(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

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방법 및 재료:
렉틴 경로 특이적 C4 분열 측정법: C4 분열 측정법은 L-피콜린에 결합하는, 에스. 아우레우스 (S. aureus)의
지질타이코산 (LTA)으로부터 렉틴 경로 활성화 결과를 측정하는 문헌 Petersen, et al., J. Immunol. Methods
257:101 (2001)에 설명되어 있다. 측정법 (실시예 11)은 후술하는 바와 같이 MASP-2 -/- 마우스 혈청을 첨가
하기 전에 LPS 및 만난 또는 지모산의 플레이트를 피복함으로써 MBL에 의한 렉틴 경로 활성화를 측정하도록
전환되었다. 측정법은 변형되어 고전적 경로에 기인한 C4 분열의 가능성을 제거하였다. 이는 1 M NaCl 함유
시료 희석 완충액을 사용하여 달성하였으며, 렉틴 경로 인식 성분이 이들의 리간드에 고친화도로 결합하는 것
을 가능하게 하나 내재 C4 활성화를 예방하여, 따라서 C1 복합체의 분해에 의한 고전적 경로의 관여를 배제한
다. 요약하자면, 변형된 측정법에서 혈청 시료 (고염 (1 M NaCl) 완충액으로 희석)를 리간드-피복 플레이트에
첨가하고, 그 다음 생리학적 염농도의 완충액 내에서 일정량의 정제된 C4를 첨가한다. MASP-2를 함유한 결합
된 인식 복합체는 C4를 분해하고, C4b가 침착된다.
측정법:
1) Nunc Maxisorb 마이크로리터 플레이트 (Maxisorb, Nunc, Cat. No. 442404, Fisher Scientific)를 1㎍/㎖
만난 (M7504 Sigma) 또는 피복 완충액 (15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, pH 9.6)으로 희석된 모든 다른 리간드
(예컨대, 예컨대 하기 열거된 것)로 피복시켰다.
다음의 시약을 측정법에 사용하였다:
a. 만난 (1㎍/웰 만난 (M7504 Sigma) 100㎕ 피복 완충액 용액):
b. 지모산 (1㎍/웰 지모산 (Sigma) 100㎕ 피복 완충액 용액);
c. LTA (1㎍/웰 100㎕ 피복 완충액 용액 또는 2㎍/웰 20㎕ 메탄올 용액)
d. 1㎍의 H-피콜린 특이적 Mab 4H5 피복 완충액 용액
e. 아에로코커스 비리단스 (Aerococcus viridans)의 PSA (2㎍/웰 100㎕피복 완충액 용액)
f. 100㎕/웰의 포르말린-고정 에스. 아우레우스 (S. aureus) DSM20233 (OD550=0.5)의 피복 완충액 용액.
2) 플레이트를 4℃에서 밤샘 (overnight) 배양하였다.
3) 밤샘 배양후, 잔여 단백질 결합 부위를 1-3 시간 동안 0.1% HSA-TBS 차단 완충액 (0.1% (w/v) HSA의 10 mM
Tris-CL용액, 140 mM NaCl, 1.5 mM NaN3, pH 7.4)으로 배양된 플레이트에 의하여 포화시켰으며, 그 다음 플레
2+ (
이트를 TBS/tween/Ca TBS, 0.05% Tween 20 및 5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 포함, pH 7.4)로 3회 세척하였다.
4) 시험된 혈청 시료를 MBL-결합 완충액 (1 M NaCl)로 희석하였고, 희석된 시료를 플레이트에 첨가하고, 4℃
에서 밤샘 배양하였다. 완충액을 넣은 웰은 음성 대조군로서만 사용하였다.
5) 4℃에서 밤샘 배양 후, 플레이트를 TBS/tween/Ca 2+
로 3회 세척하였다. 인간 C4 (100㎕/웰의 1㎍/㎖ BBS 희
석 용액 (4 mM 바르비톨, 145 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH 7.4))를 플레이트에 첨가하고 37℃에서 90
분간 배양하였다. 플레이트를 다시 TBS/tween/Ca 2+
로 세척하였다.
6) C4b 침착은 알카라인 포스파타아제-접합 닭 항-인간 C4c (1:1000 희석 TBS/tween/Ca 2+
용액)으로 검출되었
으며, 이를 플레이트에 첨가하고, 실온에서 90분간 배양시켰다. 플레이트를 TBS/tween/Ca 2+
로 다시 3회 세척하
였다.
7) 알카라인 포스파타아제는 100㎕의 ρ-니트로페닐 포스페이트 기질 용액에 첨가하고, 실온에서 20분간 배양
한 뒤, 마이크로리터 플레이트 리더 내에서 OD450를 읽음으로써 검출하였다.
공개특허 10-2012-0099680
결과: 도 6a 및 b는 MASP-2+/+의 혈청 희석액 (십자형), MASP-2+/- (폐쇄 원) 및 MASP-2-/- (폐쇄 삼각형) 내
의 만난 (도 6a) 및 지모산 (도 6b) 상의 C4b 침착량을 나타낸다. 도 6c는 야생형 혈청에 정상화된 C4b 침착
량의 측정에 기초하여 야생형 마우스 (n=5)에 비하여 MASP-2-/+ 마우스 (n=5) 및 MASP-2-/- 마우스 (n=4)의
지모산 (백색 바) 또는 만난 (음영 바)으로 피복된 플레이트상의 상대적인 C4 전환효소 활성을 나타낸다. 에
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