(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

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에서 얼음상 밤샘 배양하였다. 이 혼합물을 80 ㎕의 TBS-Ca2+/BSA 완충액으로 희석하고 만난-피복 웰에 첨가
하였다. 모든 후속적 과정을"C4 침착 측정법"에 설명한 바와 같이 수행하였다.
결과
도 20: sMAP 유전자의 표적화 파괴. (A) MASP-2/sMAP 유전자, 표적화 벡터, 및 표적화 상동체의 부분적 제한
맵. sMAP-특이적 엑손 (엑손 5)을 네오 유전자 카세트로 대체. (B) 수컷 키메라 마우스와 암컷 C57BL/6J 마우
스 교배로 유도된 자손의 게놈 DNA 서던 블롯 분석. 테일 DNA는 BamH I로 분해되고, (A)가 결핍된 프로브와
혼성화된다. 11-kbp 밴드가 야생형 상동체에서 유도되고, 6.5-kbp 밴드가 표적화 상동체에서 유도된다. (C)
PCR 유전형 분석. 테일 DNA를 엑손 4-특이적 및 네오 유전자-특이적 센스 프라이머 및 엑손 6-특이적 안티센
스 프라이머의 혼합물을 사용하여 분석하였다. 2.5-kbp 밴드를 야생형 상동체에서 획득하였으며, 1.8-kb 밴드
를 표적화 상동체에서 획득하였다.
도 21: 동종접합 (-/-) 마우스 내의 sMAP 및 MASP-2 mRNAs 발현. (A) 노던 블롯 분석. 야생형 (+/+) 및 동종
접합 (-/-) 마우스 간의 폴리 (A)+ RNAs를 전기영동하고, 나일론 막에 전이시키고, 및 sMAP, MASP-2 H-사슬,
MASP-2 L-사슬, 또는 네오 유전자에 특이적인 32P-표지 프로브와 혼성화하였다. 네오 (2.2 kb)에 특이적 밴드
를 동종접합 (-/-) 마우스에서 관찰하였다. (B) 정량적 RT-PCR. MASP-2 H- 및 L-사슬 및 sMAP cDNA 단편이
LightCycler 기기 (Roche Diagnostics) 내에서 실시간 PCR에 의하여 증폭되었다. 야생형 (+/+) 및 동종접합
(-/-) 마우스 간의 폴리 (A)+ RNAs에서 합성된 cDNA를 템플릿으로 사용하였다. 나타낸 데이터는 두 실험의 평
균이다.
도 22: 동종접합 (-/-) 마우스 혈청 내의 MASP-2 결핍. (A) 마우스 혈청내의 MASP-2 및 sMAP의 면역블롯팅.
야생형 (+/+) 또는 동종접합 (-/-) 마우스 혈청 (2 ㎕)에 면역블롯팅을 하고 항-MASP-2/sMAP 항혈청을 검출하
였다. (B) MBL-MASP-sMAP 복합체 내의 MASPs 및 sMAP 검출. 마우스 혈청은은 만난-아가로스 겔로 배양되었으
며, 겔에 결합된 MBL 복합체내의 sMAP, MASP-1, 및 MASP-2 재료 및 방법에 설명한 바와 같이 검출하였다.
도 23: 동종접합 (-/-) 마우스 혈청내의 C4 및 C3의 분열 감소. (A) 만난-피복 웰상의 C4 침착. 마우스 혈청
은 2-배로 희석되고, 만난-피복 웰에서 실온으로 30 분간 배양한다. 웰 세척 후, 인간 C4를 각 웰에 첨가하고
얼음상에서 30 분간 배양하였다. 웰에 침착된 인간 C4의 양을 HRP-접합 항-인간 C4 다클론 항체를 사용하여
측정하였다. (B) 만난-피복 웰상의 C3 침착. 희석된 마우스 혈청을 만난-피복 웰에 첨가하고 37도로 1시간 배
양하였다. 웰상의 내재 C3 침착은 HRP-접합 항-인간 C3c 다클론 항체로 검출되었다.
도 24: sMAP 및 MASP-2와 MBL의 경쟁적 결합. (A) 동종접합 (-/-) 마우스 혈청내의 MBL-MASP-sMAP 복합체의
재구성. MASP-2i 및/또는 rsMAP (4 ㎍)을 동종접합 (-/-) 마우스 혈청 (20 ㎕)으로 배양하였다. 이 혼합물에
만난-아가로스 겔로 추가의 배양을 하였으며, 겔에 결합된 분획상의 rsMAP 및 MASP-2i가 면역블롯팅에 의하여
검출되었다. (B) 다양한 양의 MASP-2i (0-5 ㎍) 및 일정량의 rsMAP (5 ㎍)을 동종접합 (-/-) 마우스 혈청 (20
㎕)으로 배양하고, 만난-아가로스 겔로 추가 배양하였다. (C) 일정량의 MASP-2i (0.5 ㎍) 및 다양한 양의
rsMAP (0-20 ㎍)를 동종접합 (-/-) 마우스 혈청 (20 ㎕)으로 배양하였다. (D) 다양한 양의 rsMAP (0-20 ㎍)를
야생형 (+/+) 마우스 혈청 (20 ㎕)로 배양하였다.
도 25: rMASP-2 첨가에 의한 C4 침착 활성의 복구. 다양한 양의 rsMAP (0-5 ㎍) (A) 또는 rMASP-2 (0-1.5 ㎍)
(B)를 총부피 20 ㎕의 TBS-Ca2+ 완충액에서 0.5 ㎕의 동종접합 (-/-) 마우스 혈청로 얼음상 밤샘 배양하였다.
그 다음 이 혼합물을 80 ㎕의 TBS-Ca2+/BSA 완충액으로 희석하고,만난-피복 웰에 첨가하였으며, 웰에 침착된
C4의 양을 측정하였다.
도 26: sMAP 첨가에 의한 C4 침착 활성의 감소. (A) rMASP-2 (1 ㎍) 및 다양한 양의 rsMAP (0-0.5 ㎍)를 0.5
㎕의 동종접합 (-/-) 마우스 혈청으로 배양하였다. 이 혼합물을 만난-피복 웰에 첨가하고, 웰에 침착된 C4의
양을 측정하였다 (B) rsMAP (0-0.7 ㎍)를 야생형 혈청 (0.5 ㎕)으로 배양하였으며, 만난-피복 웰에 침착된 C4
의 양을 측정하였다.
결과:
동종접합 (-/-) 마우스내의 sMAP 및 MASP-2 발현
공개특허 10-2012-0099680
생체 내 sMAP의 역할을 분명히 하기 위하여, 우리는 sMAP가 결핍된 유전자 표적화 마우스를 확립하였다. 표적
화 벡터는 sMAP에 특이적 엑손 (엑손 5)을 네오마이신 내성 유전자 카세트로 대체하도록 구축하였다 (도
20a). 양성 ES 클론은 C57BL/6 포배 내로 주입되고, 시조 키메라는 C57BL/6J 암컷으로 배양되었다. 기니아픽-
색 퍼프의 테일 DNA 서던 블롯 분석은 표적화 상동체의 세균 전이를 나타낸다 (도 20b). 이종접합 (+/-) 마우
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