(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

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어 있으며, 이는 L-피콜린에 결합하는 S. aureus의 지질타이코산 (LTA)의 렉틴 경로 활성화 결과를 측정한다.
시약: 포르말린-고정 S. aureous (DSM20233)를 다음과 같이 제조한다: 박테리아를 트립틱 소이 혈액 배지 내
에서 37℃로 밤샘 성장시키고, PBS로 3회 세척한 후, PBS/0.5% 포르말린 내에서 실온으로 1시간 동안 고정시
켰으며, 피복 완충액 (15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, pH 9.6)에 재현탁되기 전에 PBS로 추가로 3회 세척하였다.
측정법: Nunc MaxiSorb 마이크로리터 플레이트 (Nalgene Nunc International, Rochester, NY)의 웰은: 100 ㎕
의 포르말린-고정 S. aureus DSM20233 (OD55Q = 0.5)의 피복 완충액 용액과 1 ug의 L-피콜린의 피복 완충액
용액으로 피복되었다. 밤샘 배양 후, 웰은 0.1% 인간 혈청 알부민 (HSA)의 TBS (10 mM Tris-HCl, 140 mM
NaCl, pH 7.4) 용액으로 차단시켰으며, 그 다음 0.05% Tween 20 및 5 mM CaCl2을 함유한 TBS (세척 완충액)으
로 세척하였다. 인간 혈청 시료는 2O mM Tris-HCl, 1M NaCl, 1O mM CaCl2, 0.05% Triton X-100, 0.1% HSA, pH
7.4 내에서 희석되었으며, 이는 내재 C4의 활성화를 예방하고, C1 복합체 (C1q, C1r 및 C1s로 구성)을 분해한
다. 항-MASP-2 MoAbs 및 억제 펩티드를 포함하는 MASP-2 억제제에 다양한 농도의 혈청 시료를 첨가한다. 희석
된 시료를 플레이트에 첨가하고 4℃로 밤샘 배양하였다, 24시간 후, 플레이트를 세척 완충액으로 철저하게 세
척하고, 그 다음 0.1 ㎍의 정제된 인간 C4 (Dodds, A.W., Methods Enzymol. 223:46, 1993)의 100 ㎕의 4 mM
바르비탈, 145 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH 7.4 용액을 각 웰에 첨가한다. 37℃에서 1.5 시간 후, 플
레이트를 다시 세척하고, C4b 침착을 알카라인 포스파타아제-접합 닭 항-인간 C4c (Immunsystem, Uppsala,
Sweden)를 사용하여 검출하고 및 비색 기질 p-니트로페닐 포스페이트을 사용하여 측정한다.
만난상의 C4 측정법: 전술한 측정법은 다양한 MASP-2 억제제와 혼합된 혈청에 첨가하기 전에 LSP 및 만난을
보유한 피복에 의하여 MBL을 통하여 렉틴 경로 활성화를 측정하도록 변형될 수 있다.
H-피콜린 (Hakata Ag)상의 C4 측정법: 전술한 측정법은 다양한 MASP-2 억제제와 혼합된 혈청에 첨가하기 전에
LSP 및 H-피콜린을 보유한 피복에 의하여 H-피콜린을 통하여 렉틴 경로 활성화를 측정하도록 변형될 수 있다.
실시예 12
다음의 측정법은 야생형 및 MASP-2-/- 마우스 내의 고전적 경로 활성화의 존재를 입증한다.
방법: 면역 복합체는 피복 마이크로리터 플레이트 (Maxisorb, Nunc, cat. No. 442404, Fisher Scientific)에
의하여 0.1% 인간 혈청 알부민의 10 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7.4 용액으로 1 시간 동안 실온에서 그 자체로
생성되며, TBS/tween/Ca 2+
로 1:1000 희석된 양 항 전혈청 항혈청 (Scottish Antibody Production Unit,
Carluke, Scotland)으로 4℃에서 밤샘 배양된다. 혈청 시료는 야생형 및 MASP-2-/- 마우스에서 획득하며, 피
복된 플레이트에 첨가된다. 대조군 시료는 C1q는 야생형 및 MASP-2-/- 혈청 시료에서 고갈되도록 제조된다.
C1q-결핍 마우스 혈청은 제조자의 지시에 따라 레빗 항-인간 C1q IgG (Dako, Glostrup, Denmark)로 피복된 단
백질-A-커플 다이나비드 (Dynal Biotech, Oslo, Norway)를 사용하여 제조된다. 플레이트를 37℃에서 90분 동
안 배양된다. 결합된 C3b는 TBS/tw/ Ca ++
로 1:1000 희석된 다클론 항-인간-C3c 항체 (Dako A 062)로 검출된다.
2차 항체는 염소 항-레빗 IgG이다.
결과: 도 9는 IgG in 야생형 혈청, MASP-2-/- 혈청, C1q-결핍 야생형 및 C1q-결핍 MASP-2-/- 혈청으로 피복된
플레이트상의 상대적 C3b 침착 수준을 나타낸다. 이러한 결과는 고전적 경로가 MASP-2-/- 마우스 균주 내에서
무손상이라는 것을 입증한다.
실시예 13
다음의 측정법은 고전적 경로가 면역 복합체에 의하여 개시된 증상하에서 MASP-2 억제제의 효과를 분석함으로
써 MASP-2 억제제가 고전적 경로를 차단하는지 여부를 시험하는데 사용된다.
방법: 고전적 경로가 면역 복합체에 의하여 개시된 보체 활성화 증상의 MASP-2 억제제 효과를 시험하기 위하
여, 3벌의 90% NHS를 함유한 50 ㎕ 시료를 10 ㎍/㎖의 면역 복합체 (IC) 또는 PBS의 존재하에 37℃에서 배양
하였으며, 동일한 3벌의 시료 (+/-IC)는 37℃ 배양시 200 nM 항-프로퍼딘 단클론 항체를 함유하도록
포함된다. 두시간의 37℃ 배양 후, 13 mM EDTA를 모든 시료에 첨가하여 추가의 보체 활성화를 종결시켰으며,
시료를 즉시 5℃로 냉각하였다. 그 다음 제조자의 지시에 따라 ELISA 키트 (Quidel, Catalog Nos. AO 15 and
A009)를 사용하여 보체 활성화 산물 (C3a 및 sC5b-9)을 측정하기 전에 시료를 -70℃로 저장하였다.
실시예 14
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공개특허 10-2012-0099680