(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

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면역글로블린 성분 서열을 기능적으로 재배열하고, 내재 면역글로블린 유전자를 발현하지 않으면서 인간 면역
글로블린 유전자에 의하여 암호화된 다양한 아이소타입의 항체의 레퍼토리를 발현할 수 있다.
이러한 특성을 보유한 포유류의 생산 및 특성은, 예를 들면 Thomson, A.D., Nature 148:1547-1553, 1994, 및
Sloane, B. F., Nature Biotechnology 14:826, 1996에 설명되어 있다. 마우스 항체 유전자가 불활성화되었으
며 기능적으로 인간 항체 유전자로 대체되도록 유전자 조작된 마우스 주는 구득할 수 있다 (예컨대,
XenoMouse
, Abgenix, Fremont CA). 결과 자손 마우스는 인간 요법에 사용되기 적합한 인간 MASP-2에 대한 인간 MoAb를
생산할 수 있다.
실시예 10
이 실시예는 인체적응형 뮤린 항-MASP-2 항체 및 항체 단편의 생성 및 생산을 설명한다.
뮤린 항-MASP-2 단클론 항체가 수컷 A/J 마우스에서 생성되었다 (실시예 7). 뮤린 항체는 후술하는 바와 같이
인체적응화되어 뮤린 불변 영역을 인간 대응 영역으로 대체하여 항체의 키메라 IgG 및 Fab 단편을 생성함으로
써 이들의 면역원성을 감소시키며, 본 발명에 따라 인간 대상체내의 MASP-2-의존성 보체 활성화의 역효과를
억제하는데 유용하다.
1. 뮤린 하이브리도마 세포의 항-MASP-2 가변 영역 유전자의 클로닝
총 RNA는 제조사 프로토콜을 따라 RNAzol을 사용하여 하이브리도마 세포 분비 항-MASP-2 MoAb (실시예 7)에서
분리된다 (Biotech, Houston, Tex.). 제1 가닥 cDNA가 프라이머로서 올리고 dT를 사용하여 총 RNA로부터 합성
된다. PCR은 면역글로블린 불변 C 영역-유도성 3' 프라이머를 사용하여 수행되었으며, 5' 프라이머로서 뮤린
VH 또는 VK 유전자의 리더 펩티드 또는 제1 프레임워크 영역으로부터 유도된 프라이머 세트를 변성시킨다. 앵
커드 PCR은 문헌 Chen and Platsucas (Chen, P. F., Scand. J. Immunol. 35:539-549, 1992)에서 설명된 바와
같이 수행된다. VK 유전자 클로닝을 위하여, 2중 가닥 cDNA는 Not1-MAK1 프라이머 (5'-
TGCGGCCGCTGTAGGTGCTGTCTTT-3' SEQ ID NO:38)을 사용하여 제조된다. 풀린 아답터 AD1 (5'-
GGAATTCACTCGTTATTCTCGGA-3' SEQ ID NO:39) 및 AD2 (5'-TCCGAGAATAACGAGTG-3' SEQ ID NO:40)는 2중 가닥 cDNA
의 5' 및 3' 말단 모두에 결찰된다. 3' 말단의 아답터는 Not1 분해에 의하여 제거된다. 분해 산물은 그 다음
5' 프라이머로서 AD1 올리고뉴클레오티드 및 3' 프라이머로서 MAK2 (5'-CATTGAAAGCTTTGGGGTAGAAGTTGTTC-3'
SEQ ID NO:41)와 함께 템플릿으로서 PCR에 사용된다. 약 500 bp의 DNA 단편이 pUC19 내로 클론된다. 클론된
서열이 기대되는 뮤린 면역글로블린 불변 영역을 포함한다는 사실을 입증하기 위한 서열 분석을 위하여 수개
의 클론이 선택된다. Not1-MAK1 및 MAK2 올리고뉴클레오티드는 VK 영역에서 유도되었으며, 각각 C 카파 유전
자의 최초 염기짝으로부터 하방 182 및 84 bp 였다. 클론은 완전한 VK 및 리더 펩티드를 포함하여
선택되었다.
VH 유전자의 클로닝을 위하여, 이중-가닥 cDNA는 Not1-MAG1 프라이머 (5'-CGCGGCCGCAGCTGCTCAGAGTGTAGA-3'
SEQ ID NO:42)를 사용하여 제조된다. 풀린 아답터 AD1 및 AD2는 2중 가닥 cDNA의 5' 및 3' 말단 모두에 결찰
된다. 3' 말단의 아답터는 Not1 분해에 의하여 제거된다. 분해 산물은 AD1 올리고뉴클레오티드 및 프라이머로
서 MAG2 (5'-CGGTAAGCTTCACTGGCTCAGGGAAATA-3' SEQ ID NO:43)와 함께 템플릿으로서 PCR에 사용된다. 500 내지
600 bp 길이의 DNA 단편 pUC19 내로 클론되었다. Not1-MAG1 및 MAG2 올리고뉴클레오티드는 뮤린 Cγ.7.1 영역
으로부터 유도되었으며, 각각 뮤린 Cγ.7.1 유전자의 최초 bp로부터 하방 180 및 93 bp였다. 클론은 완전 VH
및 리더 펩티드를 포함하도록 선택되었다.
2. 키메라 MASP-2 IgG 및 Fab를 위한 발현 벡터의 구축.
공개특허 10-2012-0099680
전술한 클론된 VH 및 VK 유전자는 PCR 반응에서 템플릿으로 사용되어 Kozak 컨센서스 서열의 5' 말단 및 스플
라이스 공여자의 3' 말단의 뉴클레오티드 서열에 첨가된다. 서열의 PCR 에러 부재를 확인하기 위한 분석 후,
VH 및 VK 유전자가 각각 인간 C.γ1 및 C. 카파를 함유하는 발현 벡터 카세트 내로 삽입되어, pSV2neoVH-
huCγ1 및 pSV2neoV-huCγ를 산출한다. 중쇄- 및 경쇄 벡터의 CsCl 성분-정제 플라스미드 DNA가 전기천공에
의한 COS 세포의 전달감염에 사용된다. 48시간 후, 배양 상청액을 ELISA로 시험하여 약 200 ng/㎖의 키메라
IgG의 존재를 확인하였다. 세포를 수확하고, 총 RNA를 제조하였다. 제1 가닥 cDNA는 프라이머로서 올리고 dT
를 사용하여 총 RNA로부터 합성된다. 이 cDNA는 PCR에서 템플릿으로 사용되어 Fd 및 카파 DNA 단편을 생성한
다. Fd 유전자를 위하여, PCR은 5' 프라이머로서 5'-AAGAAGCTTGCCGCCACCATGGATTGGCTGTGGAACT-3' (SEQ ID
NO:44) 및 CHI-유도성 3' 프라이머 (5'-CGGGATCCTCAAACTTTCTTGTCCACCTTGG-3' SEQ ID NO:45)를 사용하여 수행
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