(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

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면역 방어에 대한 렉틴 경로의 중요성은, 특히 후천적 면역 시스템이 확립되기 전 유아기에 다양한감염성 질
환에 대한 증가된 감수성을 지닌 MBL의 결핍에 관한 다수의 임상적 연구들에서 지적하였다 (Jack et al.,
Immunol Rev 180: 86-99 (2001); Neth et al. Infect Immun 68: 688-693 (2000); Summerfield et al, Lancet
345: 886-889 (1995); Super et al., Lancet 2: 1236-1239 (1989)). 그러나, 렉틴 경로는 또한 소망하지 않는
보체 활성화에 기여하며, 이는 다수의 병리학적 증상, 예컨대 심장 및 신장의 허혈/관류 손상 내의 염증 및
조직 손상에 관여한다 (de Vries et al., Am J Pathol 165: 1677-1688 (2004); Fiane et al., Circulation
108: 849-856 (2003); Jordan et al., Circulation 104: 1413-1418 (2001); Walsh et al., J Immunol 175:
541-546 (2005)).
전술한 바와 같이, 렉틴 경로는 MBL 및 피콜린에 의하여 탄수화물 인식에 관여하며 (Fujita et al, Immunol
Rev 198: 185-202 (2004); Holmskov et al, Annu Rev Immunol 21: 547-578 (2003); Matsushita and Fujita,
Immunobiology 205: 490-497 (2002) 이러한 렉틴은 MASP-1 (Matsushita and Fujita, J Exp Med 176: 1497-
1502 (1992); Sato et al, lnt Immunol 6: 665-669 (1994); Takada et al, Biochem Biophys Res Commun 196:
1003-1009 (1993), MASP-2 (Thiel et al, Nature 386: 506-510 (1997), MASP-3 (Dahl et al, Immunity 15:
127-135 (2001), 및 MASP-2의 절단된 단백질 (소형 MBL-유관 단백질; sMAP 또는 MApl9) (Stover et al, J
Immunol 162: 3481-3490 (1999); Takahashi et al, lnt Immunol 11: 8590863 (1999)과 복합체를 형성한다.
MASP족 구성원은 6개의 도메인으로 구성되어 있다; 두 C1r/C1s/Uegf/골형성 단백질 (CUB) 도메인, 표피 성장
인자 (EGF)-유사 도메인, 두 보체 대조군 단백질 (CCP) 또는 짧은 컨센서스 반복 (SCR) 도메인, 및 세린 프로
테아제 도메인 (Matsushita et al, Curr Opin Immunol 10: 29-35 (1998). MASP-2 및 sMAP는 단일 구조 유전자
로부터 대체 스플라이싱에 의하여 생성되며, sMAP는 제1 CUB (CUBI) 도메인, EGF-유사 도메인 및 sMAP-특이적
엑손에 의하여 암호화된 C-말단부의 여분의 4 아미노산으로 구성되어 있다. MASP-1 및 MASP-3는 대체 스플라
이싱에 의한 단일 유전자로부터 생성될 수 있다 (Schwaeble et al, Immunobiology 205: 455-466 (2002). MBL
및 피콜린이 마이크로브의 표면상의 탄수화물에 결합하는 경우, 효소전구체 형태의 MASP는 제2 CCP와 프로테
아제 도메인 사이를 분해하여 중쇄 (H)- 및 경쇄 (L)-사슬로 불리는 두 폴리펩티드로 구성된 활성 형태가 된
다. 따라서 보체 성분에 대한 단백질분해 활성을 획득하게 된다. 축적된 증거는 MASP-2가 C3 전환효소
(C4bC2a)의 형성을 유도하는 C4 및 C2를 분해함을 나타낸다 (Matsushita et al, J. Immunol 165: 2637-2642
(2000)). 우리는 MASP-1이 C3를 직접적으로 분해하며 및 후속적으로 증폭 루프를 활성화시킨다는 것을 제안한
다 (Matsushita and Fujita, Immunobiology 194: 443-448 (1995). 그러나 이 기능은 논란이 있다 (Ambrus et
al, J. Immunol 170: 1374-1382 (2003). MASP-3가 L-사슬내의 세린 프로테아제 도메인을 함유하고, 합성 기질
에 대한 이들의 단백질분해 활성을 발휘함에도 (Zundel et al, J Immunol 172: 4342-4350 (2004), 이들의 생
리학적 기질은 확인되지 못하였다. 세린 프로테아제 도메인이 결핍된 sMAP의 기능은 여전히 미지이다.
현재의 연구에서, 렉틴 보체 경로의 활성화에서의 sMAP의 역할을 분명히 하기 위하여, 우리는 sMAP의 C-말단
부에서 4 아미노산 잔기 (EQSL)를 암호화하는 sMAP-특이적 엑손을 파괴시켰으며, sMAP-/- 마우스를 생성하였
다. 우리는 하방-조절 렉틴 경로의 활성화에 대한 sMAP의능력을 최초로 보고하였다.
재료 및 방법
마우스
표적화 벡터는 129/Sv 마우스 MASP-2 유전자의 엑손 1-4 및 엑손 6의 일부 및 엑손 5 대신 네오마이신 내성
유전자 카세트를 포함하도록 구축된다 (도 20a). DT-A 유전자는 벡터의 3' 말단에 삽입되고 및 3개의 lox p
부위는 장래에 네오마이신 카세트 및 프로모터 영역을 제거하기 위하여 조건부 표적화를 수행하도록
삽입된다. 표적화 벡터는 129/Sv ES 세포내로 전기천공되었다. 표적화된 ES 클론은 양육 ICR 모체의 자궁내로
이식된 C57BL/6J 포배내로 미세주입되었다. 수컷 키메라 마우스를 암컷 C57BL/6J 마우스와 교배시켜 이종접합
(+/-) 마우스를 생산하였다. 이종접합 (+/-) 마우스는 프로브를 사용하여 BamH I로 분해된 테일 DNA 서던 블
롯 분석에 의하여 선별되었다 (도 2Oa). 서던 블롯 분석은 이종접합 (+/-) 마우스의 DNA내에서 6.5-kbp 및
11-kbp 밴드를 나타낸다 (도 20b). 이종접합 (+/-) 마우스는 C57BL/6J 마우스와 역교배되었다. 동종접합 (-/-
) 마우스를 획득하기 위하여, 이종접합 (+/-) 마우스를 이종교배하였다. 동종접합 (-/-) 마우스 (C57BL/6J 배
경)를 테일 DNA의 PCR-기초 유전형에 의하여 확인하였다. PCR 분석은 엑손 4-특이적 및 네오 유전자-특이적
센스 프라이머 및 엑손 6-특이적 안티센스 프라이머의 혼합물을 사용하여 수행하였다. 동종접합 (-/-) 마우스
의 DNA는 단일 1.8-kbp 밴드를 나타내었다 (도 20c). 모든 실험에서, 8 내지 12 주령 마우스를 Fukushima
Medical University의 동물 실험 가이드에 따라 사용하였다.
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공개특허 10-2012-0099680