(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

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sMAP는 억제제 후보의 하나가 될 수 있다.
실시예 31
이 실시예는 MASP-2가 C3의 C4 우회 활성화에 대한 역할한다는 것을 입증한다.
배경/이론적 근거: 최근, 대체 경로의 억제가 허혈 급성 기능상실로부터 신장을 보호한다는 것을 보여주었다
(Thurman et al., J. Immunol 170: 1517-1523 (2003)). 본원의 데이터는 렉틴 경로가 대체 경로-활성화를 지
시하고, 차례로 보체 활성화를 시너지적으로 증폭시킨다는 것을 의미한다. 우리는 렉틴 경로의 일시적 억제가
대체 경로-활성화에 영향을 미치며, 따라서 보체-매개 이식편 손상 및 염증을 제한하여 장기 이식의 장기간의
결과를 향상시키며 이식편에 대한 후천적 면역 반응의 원치않는 유도를 완화하고, 후천적 면역 시스템을 통한
2차 이식편 거부반응을 감소시킨다는 가설을 세웠다. 이는 선천적 MBL 결핍에 의한 렉틴 경로의 부분적 손상
을 나타내는 최근 임상적 데이터에 의하여 지지된다 (약 30%의 인구에서 나타남), 증가된 신장 동종이식의 인
간 생존에 관련된 것이다 (Berger, Am J Transplant 5: 1361-1366 (2005)).
허혈-재관류 (I/R) 손상에서의 보체 성분 C3 및 C4의 관여는 유전자 표적화 마우스주를 사용하여 일시적 창자
및 근육 허혈의 모델에서 잘 확립되었다 (Weiser et al., J Exp Med 183: 2342-2348 (1996); Williams et al.
J Appl Physiol 86: 938-42, (1999)). C3는 신장 VR 손상 및 2차 이식편 거부반응에 상당한 역할을 하는 것으
로 알려져 있다 (Zhou et al., J CHn Invest 105: 1363-1371 (2000); Pratt et al., Nat Med 8: 582-587
(2002); Farrar, et al., Am J. Pathol 164: 133-141 (2004)). C4 결핍의 표현형이 마우스 신장 동종이식편
거부반응 모델에서 관찰되지 않는 다는 것은 놀라운 것이다 (Lin, 2005 In Press). 이러한 C4 결핍 마우스의
혈청 및 혈장의 후속적 분석은, 그러나 이러한 마우스가 C3의 LP-의존성 분열 및 추가의 보체의 하방 활성화
를 나타내는 잔여 기능성 활성을 보유한다는 것을 의미한다 (도 27c).
기능성 C4-우회 (C2-우회)의 존재는 다수의 연구자들이 전술한 (그런나 완전하게 특성화되지 않은) 현상이며
(Miller et al., Proc Natl Acad Sci 72: 418-22 (1975); Knutzen Steuer et al, J Immunol 143 (7): 2256-61
(1989); Wagner et al., J Immunol 163: 3549-3558 (1999), 이는 C4 (및 C2) 결핍 혈청내의 대체 경로-비의존
성 C3-전환에 관련되어 있다.
방법: C3 침착에 대한 렉틴 경로 및 고전적 경로의 효과. 마우스 혈장 (EGTA/ Mg2+, 항응고제)을 희석하고,
4.0 mM 바르비탈, 145 mM NaCl, 2.0 mM CaCl2, 1.0 mM MgCl2, pH 7.4로 재칼슘화하였고, 그 다음 만난 (도 27a
및 27c에 나타낸 바와 같이) 또는 지모산 (도 27b에 나타낸 바와 같이)으로 피복된 미세티터 플레이트에 첨가
하였으며, 90 분간 37℃로 배양하였다. 플레이트를 10 mM Tris-Cl, 14O mM NaCl, 5.O mM CaCl2, 0.05% Tween
20, pH 7.4로 3회 세척하고, 그 다음 항-마우스 C3c 항체를 사용하여 C3b 침착을 측정하였다.
결과: 도 27 a 내지 c에 나타낸 결과는 3회의 비의존성 실험의 대표적인 것이다. 만난 또는 지모산 대신 면역
글로블린 복합체로 피복된 웰 내의 동일한 혈청을 사용하는 경우, C3b 침착 및 인자 B 분열이 WT (+/+) 마우
스 혈청 및 풀을 형성한 MASP-2 (-/-) 혈청에서 관찰되었으나, C1q 결핍 혈청에서는 관찰되지 않았다 (데이터
미도시). 이는 개시 C3b가 CP 활성을 통하여 제공되는 경우 대체 경로 활성화가 MASP-2-/- 혈청내에서 복구될
수 있다는 것을 의미한다. 도 27c는 C3는 C4 (-/-) 결핍 혈장내에서 렉틴 경로-의존성 방식으로 효과적으로
활성화될 수 있다는 놀라운 사실을 나타낸다. 이 "C4 우회"는 가용성 만난 또는 만노스를 지닌 혈장의 사전
배양을 통하여 렉틴 경로-활성화의 억제에 의하여 폐쇄된다.
만난 및 지모산상에 C3b 침착은 MASP-2 (-/-) 결핍 마우스내에서 심각하게 저하되며, 대체 경로 활성화에 대
한 이전의 다수의 논문에 따른 실험 조건하에서도 모든 세 경로를 허용하게 된다. 도 27 a 내지 c에 나타낸
바와 같이, MASP-2 (-/-) 결핍 마우스 혈장은 렉틴 경로를 통한 C4를 활성화시키지 않으며 렉틴 경로 또는 대
체 경로를 통해서도 C3를 분해하지도 않는다. 따라서 우리는 MASP-2가 이 C4-우회에 필요하다는 가설을 세웠
다. 렉틴 경로-의존성 C4-우회에 관여하는 것으로 보이는 성분의 확인에 있어서 추가의 진전은 최근 Teizo
Fujita 교수에 의하여 보고되었다. 후지타 MASP- 1/3 결핍 마우스 균주와 교배한 C4 결핍 마우스의 혈장은 C4
결핍 혈장의 렉틴 경로에 의한 C3 분해의 능력을 잃었다. 이는 재조합 MASP-1를 결합된 C4 및 MASP-1/3 결핍
혈장에 첨가함으로써 복구되었다 (Takahashi, MoI Immunol 43: 153 (2006). 이는 MASP-1가 C4의 부재하에 C3
를 분해하는 렉틴 경로-유도성 복합체의 형성에 관여한다는 것을 의미한다 (재조합 MASP-1는 C3가 아닌, C2를
분해한다; Rossi et al, J Biol Chem 276: 40880-7 (2001); Chen et al, J Biol Chem 279: 26058-65 (2004).
우리는 MASP-2가 형성된 이 우회에 필요하다는 것을 관찰하였다.
공개특허 10-2012-0099680
더 많은 기능성 및 정량적 변수 및 조직학이 이 파일럿 연구를 공고히하기 위하여 필요하나, 이들의 예비적
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