(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

[0603]
[0604]
[0605]
[0606]
[0607]
[0608]
Tween 20의 PBS 용액)으로 5회 세척하고, 그 다음 200 ㎕의 PBS로 2회 세척하였다. 100 ㎕/웰의 1:700 희석
바이오틴-접합 닭 항-인간 C4c (Immunsystem AB, Uppsala, Sweden)를 2.0 mg/㎖ 보빈 혈청 알부민 (BSA)을 함
유한 PBS에 첨가하고, 온건 혼합하면서 실온에서 1시간 배양하였다. 각 웰을 200 ㎕ PBS로 5회 세척하였다.
100 ㎕/웰의 0.1 ㎍/㎖의 과산화효소-접합 스트렙타비딘 (Pierce Chemical #21126)을 2.0 mg/㎖ BSA 함유 PBS
에 첨가하였으며 진탕기에서 온건 혼합하면서 실온에서 1시간 배양하였다. 각 웰을 200 ㎕의 PBS로 5회세척하
였다. 100 ㎕/웰의 과산화효소 기질 TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories)를 첨가하고, 실온에서 16분간 배
양하였다. 과산화효소 반응은 100 ㎕/웰의 1.0 M H3PO4를 첨가함으로써 중단시켰으며 OD450을 측정하였다.
3. '천연' 래트 MASP-2에 대한 항-래트 MASP-2 Fab2의 결합 측정법
배경: MASP-2는 일반적으로 특이적 렉틴 분자 (만노스-결합 단백질 (MBL) 및 피콜린)를 포함하는 MASP-2 이량
체 복합체로서 혈장내에 존재한다. 따라서, 항-MASP-2 Fab2과 생리학적 유관형인 MASP-2의 결합을 연구하는
경우, 정제된 재조합 MASP-2보다는 Fab2와 혈장내의 '천연' MASP-2의 상호작용이 사용되는 결합 측정법을 발
전시키는 것이 중요하다. 이 결합 측정법에서, 10% 래트 혈청의 '천연' MASP-2-MBL 복합체는 우선 만난-피복
웰상에 고정된다. 고정된 '천연' MASP-2에 대한 다양한 항-MASP-2 Fab2s 결합 친화도를 표준 ELISA 법을 사용
하여 연구하였다.
*방법: 96-웰 코스타 고결합 플레이트를 1 ㎍/50 ㎕/웰에서 50 mM 카보네이트 완충액으로 희석된 만난 (pH
9.5)으로 5℃로 밤샘 배양하였다. 각 웰을 200 ㎕ PBS로 3회 세척하였다. 웰을 100 ㎕/웰의 0.5% 비지방 건조
유의PBST (PBS, 0.05% Tween 20) 용액으로 차단시켰으며, 온건 혼합하면서 실온에서 1시간 배양하였다. 각 웰
을 200 ㎕의 TBS/Tween/Ca ++
세척 완충액 (Tris-완충 식염수, 0.05% Tween 20, 5.0 mM CaCl2 함유, pH 7.4)으
로 3회 세척하였다. 10% 래트 혈청의 고염 결합 완충액 용액 (20 mM Tris, 1.0 M NaCl, 10 mM CaCl2, 0.05%
Triton-X100, 0.1% (w/v) 보빈 혈청 알부민, pH 7.4)를 얼음에서 제조하였다. 100 ㎕/웰을 첨가하고, 5℃에서
밤샘 배양하였다. 웰을 200 ㎕의 TBS/Tween/Ca ++
회 세척하였다. Ca ++
및 Mg ++
세척 완충액로 3회 세척하였다. 웰을 그 다음 200 ㎕ PBS로 2
함유 GVB 완충액 (4.0 mM 바르비탈, 141 mM NaCl, 1.0 mM MgCl2, 2.O mM CaCl2,
0.1% 젤라틴, pH 7.4)으로 희석된 100 ㎕/웰의 선택된 농도의 항-MASP-2 Fab2를 첨가하였으며, 온건 혼합하면
서 실온에서 1 시간 배양하였다. 각 웰을 200 ㎕ PBS로 5회 세척하였다. 1:5000로 희석된 100 ㎕/웰의 HRP-접
합 염소 항-Fab2 (Biogeneis Cat No 0500-0099)의 2.0 mg/㎖ 보빈 혈청 알부민 PBS 용액을 첨사하였으며 온건
혼합하면서 실온에서 1시간 배양하였다. 각 웰을 200 ㎕ PBS로 5회세척하였다. 100 ㎕/웰의 과산화효소 기질
TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories)을 첨가하였으며, 실온에서 70분간 배양하였다. 과산화효소 반응 100
㎕/웰의 1.0 M H3PO4를 첨가함으로써 중단시키고 및 OD450를 측정하였다.
결과:
고친화도로 래트 MASP-2 단백질과 반응하는 약 250 개의 다른 Fab2를 ELISA 선별로 선택하였다. 이러한 고친
화도 Fab2s는 다른 항체의 유일성을 결정하기 위하여 서열화되었으며, 50개의 유일한 항-MASP-2 항체가 정제
되어 추가의 분석을 하였다. 250 ug의 각 정제된 Fab2 항체를 MASP-2 결합 친화도 특성화 및 보체 경로 기능
성 시험에 사용하였다. 이 분석 결과를 표 6에 나타내었다.
표 6
표 6: 렉틴 경로 보체 활성화를 차단하는 항-MASP-2 FAB2
Fab2 항체# C3 전환효소
Kd
공개특허 10-2012-0099680
C5 전환효소
(IC50 (nM))
(IC50 (nM))
88 0.32 4.1 ND
41 0.35 0.30 0.81
11 0.46 0.86