(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

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재료 및 방법: 인간 MASP-2를 암호화하는 미니유전자 (소위 "미니 hMASP-2") (SEQ ID NO:49, 도 5)는 인간
MASP 2 유전자의 프로모터 영역을 포함하도록 구축되며, 다음의 8 엑손의 암호화 서열을 나타내는 cDNA 서열
이 따르는 최초 3 엑손 (엑손 1 내지 엑손 3)을 포함하고, 따라서 내재 프로모터에 의하여 유도된 전장 MASP-
2 단백질을 암호화하게 된다. 미니 hMASP-2 구조체는 MASP-2-/-의 수정난에 주입되어, 인간 MASP-2를 유전자
삽입에 의하여 발현하여 결핍 뮤린 MASP 2를 대체하도록 한다.
실시예 4
이 실시예는 인간 혈청의 효소전구체 형태 내에서의 인간 MASP-2 단백질 분리를 설명한다.
인간 MASP-2 분리의 방법: 인간 혈청 MASP-2 분리 방법은 문헌 Matsushita et al., J. Immunol. 165:2637-
2642, 2000에 설명되어 있다. 요약하자면, 인간 혈청을 0.2 M NaCl, 20 mM CaCl2, 0.2 mM NPGB, 20μM ρ-
APMSF, 및 2% 만니톨을 함유하는 10 mM 이미다졸 완충액 (pH 6.0)을 사용하여 효모 만난-세파로스 컬럼에 통
과시켰다. MBL를 지닌 MASP-1 및 MASP-2 효소전구체 복합체는 0.3 M 만노스를 함유한 상기 완충액과 함께 용
출하였다. MBL에서 효소전구체 MASP-1 및 MASP-2를 분리하기 위하여, 복합체를 함유한 제조물을 항-MBL-세파
로스에 도포하고, 그 다음 MASP가 20 mM EDTA 및 1 M NaCl를 함유한 이미다졸 완충액과 함께 용출되었다. 마
지막으로, 효소전구체 MASP-1 및 MASP-2는 항-MBL-세파로스로서 사용된 동일한 완충액 내에서 항-MASP-1-세파
로스를 통과시켜 서로 분리되었다. MASP-2는 용출액에서 회수되었으나, MASP-1은 0.1 M 글리신 완충액 (pH
2.2)으로 용출되었다.
실시예 5
이 실시예는 폴리펩티드 유도성 재조합 전장 인간, 래트 및 뮤린 MASP-2, MASP-2, 및 MASP-2의 촉매 활성화된
돌연변이형의 재조합 발현 및 단백질 생산을 설명한다.
전장 인간, 뮤린 및 래트 MASP-2의 발현:
인간 MASP-2 (SEQ ID NO: 4)의 전장 cDNA 서열은 포유류 발현 벡터 pCI-Neo (Promega)내로 서브클론되었으며,
이는 CMV 증진제/프로모터 영역의 조절하에 진핵세포 발현을 유도한다 (Kaufman RJ. et al., Nucleic Acids
Research 79:4485-90, 1991; Kaufman, Methods in Enzymology, 185:531-66 (1991)). 전장 마우스 cDNA (SEQ
ID NO:50) 및 래트 MASP-2 cDNA (SEQ ID NO:53)은 pED 발현 벡터 내로 각각 서브클론되었다. MASP-2 발현 벡
터를 표준 인산 칼슘 전달감염 과정을 사용하여 유착성 차이니즈 햄스터 난소 세포주 DXB1 내로 전달감염시켰
다 (Maniatis et al., 1989). 이러한 구조체로 전달감염된 세포는 매우 느리게 성장하였으며, 암호화된 프로
테아제가 세포독성이라는 것을 암시한다.
또 다른 접근법으로써, 이의 내재 프로모터에 의하여 MASP-2의 인간 cDNA를 함유한 미니유전자 구조체 (SEQ
ID NO:49)는 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO) 내로 일시적으로 전달감염되었다. 인간 MASP-2 단백질은 배양
배지 내로 분비되었으며, 하기와 같이 분리되었다.
전장 촉매 불활성 MASP-2의 발현:
이론적 근거: 인식 하위성분 MBL 또는 피콜린 (L-피콜린, H-피콜린 또는 M-피콜린)이 이들의 개별적인 탄수화
물 패턴에 결합한 후 자가촉매성 분열에 의하여 MASP-2가 활성화된다. 자가촉매성 분열에 의한 MASP-2의 활성
화는 혈청으로부터 MASP-2 분리절차, 또는 재조합 발현 후 정제 절차 중에 종종 발생된다. 항원으로 사용되는
더욱 안정적인 단백질 제조물을 획득하기 위하여, MASP-2A로서 설계된 MASP-2의 촉매불활성 형태는 래트 (SEQ
ID NO:55 Ser617이 Ala617로); 마우스 (SEQ ID NO:52 Ser617이 Ala617로); 또는 인간 (SEQ ID NO:3 Ser618이
Ala618로) 내의 알라닌 잔기를 지닌 프로테아제 도메인의 촉매성 삼조체 (triad) 내에 존재하는 세린 잔기를
대체함으로써 생성된다.
공개특허 10-2012-0099680
촉매불활성 인간 및 뮤린 MASP-2A 단백질을 생성하기 위하여, 부위-지향 돌연변이유발은 올리고뉴클레오티드
를 사용하여 수행된다 (표 5). 표 5의 올리고뉴클레오티드는 효소 활성 세린을 암호화하는 인간 및 뮤린 cDNA
의 영역을 풀도록 설계되었으며, 올리고뉴클레오티드는 세린 코돈이 알라닌 코돈으로 변화하도록 미스매치를
함유한다. 예를 들면, PCR 올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO:56-59는 인간 MASP-2 cDNA (SEQ ID NO:4)와 조합으
로 사용되어 개시 코돈에서 효소 활성 세린 및 세린에서 종결 코돈 까지의 영역을 증폭하고 Ser618이 Ala618
가 되는 돌연변이를 함유하는 돌연변이 MASP-2A의 완전 개방 리딩형을 생성한다. PCR 산물은 표준 테일링 과
정을 사용하여 아가로스 겔 전기영동 및 밴드 제조물 및 단일 아데노신 오버랩이 생성된 후 정제되었다. 아데
노신 테일 MASP-2A는 그 다음 이. 콜리 (E. coli) 내로 형질전환된 pGEM-T 이지 벡터 내로 클론되었다.
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