(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

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에 첨가하였다. 반응은 50 ㎕의 2M H2SO4/웰을 첨가하여 종결시켰다. 반응 혼합물의 450 nm에서의 광학적 밀도
는 BioTek ELISA Reader (BioTek Instruments, Winooski, Vt.)로 읽었다.
MASP-2 결합 측정법:
상기 MASP-2 ELISA 측정법에서 양성으로 시험된 배양 상청액은 MASP-2에 대한 MASP-2 억제제결합 친화도를 측
정하기 위하여 결합 측정법으로 시험할 수 있다. 유사한 측정법이 억제제가 보체 시스템내에서 다른 항원과
결합하는지 여부를 결정하는데 사용될 수 있다.
폴리스티렌 마이크로리터 플레이트 웰 (96-웰 배지 결합 플레이트, Corning 코스타, Cambridge, MA)는 MASP-2
(20 ng/100 ㎕/웰, Advanced Research Technology, San Diego, CA)의 인산-완충 식염수 (PBS) 용액으로 pH
7.4에서 4℃로 밤샘 피복되었다. MASP-2 용액 흡인 후, 웰은 1% 보빈 혈청 알부민 (BSA; Sigma Chemical)를
함유한 PBS로 2 시간 동안 실온에서 차단되었다. MASP-2 피복이 없는 웰은 배경 대조군로 사용하였다. 차단
용액 내의 다양한 농도의 하이브리도마 상청액의 분취물 또는 정제된 항-MASP-2 MoAbs을 웰에 첨가하였다. 실
온에서의 2 시간 배양 후, 웰을 PBS로 광범위하게 린스하였다. MASP-2-결합 항-MASP-2 MoAb은 과산화효소-접
합 염소 항-마우스 IgG (Sigma Chemical)의 차단 용액의 첨가에 의하여 검출되었으며, 1 시간 동안 실온에서
배양되었다. 플레이트를 다시 PBS로 철저하게 린스되었으며, 100 ㎕의 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 (TMB) 기
질 (Kirkegaard 및 Perry Laboratories, Gaithersburg, MD)이 첨가되었다. TMB의 반응은 100 ㎕의 1M 인산 첨
가로 중단되었으며, 프레이트를 마이크로플레이트 리더로 450 nm에서 읽었다 (SPECTRA MAX 250, Molecular
Devices, Sunnyvale, CA).
양성 웰의 배양 상청액에 대하여 기능성 측정법 예컨대 C4 분열 측정법 (실시예 2)으로 보체 활성화 억제능을
시험하였다. 양성 웰 내의 세포는 제한 희석으로 클론되었다. MoAbs은 전술한 ELISA 측정법에서 hMASP-2의 반
응성이 다시 시험되었다. 선택된 하이브리도마는 스핀너 플라스크 내에서 성장되었으며, 사용된 배양 상청액
은 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의하여 항체 정제를 위하여 수거되었다.
실시예 8
이 실시예는 MASP-2 억제제에 대한 선별 모델로 사용되기 위한 인간 MASP-2 발현 MASP-2-/- 녹아웃 마우스의
생성을 설명한다.
재료 및 방법: MASP-2-/- 마우스 (실시예 1) 및 인간 MASP-2 삽입유전자 구조체를 발현하는 MASP-2-/- 마우스
(인간 MASP-2 넉-인) (실시예 3)를 교배하였으며, 뮤린 MASP-2-/-, 뮤린 map19+, 인간 MASP-2+의 자손은 인간
MASP-2 억제제를 확인하기 위하여 사용되었다.
이러한 동물 모델은 MASP-2 억제제 예컨대 인간 항-MASP-2 항체, MASP-2 억제 펩티드 및 비펩티드, 및 MASP-2
억제제를 함유한 조성물의 확인 및 효능을 위한 시험 기질로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 동물 모델은 화합
물 또는 MASP-2-의존성 보체 활성화를 촉발시킬 수있다고 알려진 약제에 노출되며, MASP-2 억제제는 노출된
동물 내에서 질환 증상의 감소를 유발할 수 있는 충분한 시간 및 농도로 동물 모델에 투여된다.
이와 함께, 뮤린 MASP-2-/-, map19+, 인간 MASP-2+ 마우스는 세포 배양 장애 모델로서 사용될 수 있는 MASP-
2-유관 질환에 관련된 하나 이상의 세포 타입을 함유하는 세포주를 생성하기 위하여 사용될 수 있다. 유전자
삽입 동물의 계속적 세포주의 생성은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 예를 들면 소형, J.A., et al, Mol.
Cell Biol, 5:642-48, 1985이다.
실시예 9
이 실시예는 인간 MASP-2 및 인간 면역글로블린을 발현하는 MASP-2 녹아웃 마우스 내에서 인간 MASP-2에 대한
인간 항체를 생산하는 방법을 설명한다.
재료 및 방법:
공개특허 10-2012-0099680
MASP-2-/- 마우스는 실시예 1에서 설명된 바와 같이 생성된다. 마우스는 실시예 3에서 설명된 바와 같이 인간
MASP-2를 발현하도록 구축되었다. 인간 MASP-2를 발현하는 동종접합 MASP-2-/- 마우스 및 MASP-2-/- 마우스를
각각 내재 면역글로블린 중쇄 및 경쇄좌의 표적화된 파괴 및 인간 면역글로블린좌의 최소한 일부의 발현하도
록 조작된 배아 줄기 세포로부터 유도된 마우스와 교배시켰다. 바람직하게는, 인간 면역글로블린좌의 일부는
중쇄 및 경쇄 성분의 미정렬 서열을 포함한다. 내재 면역글로블린 유전자의 불활성화 및 외래 면역글로블린
유전자의 도입 모두는 표적화된 상동 재조합에 의하여 달성된다. 이 프로세스의 결과인 유전자삽입 포유류는
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