(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

[0446]
[0447]
[0448]
[0449]
[0450]
[0451]
[0452]
[0453]
[0454]
[0455]
[0456]
러 바는 표준 편차를 나타낸다. 도 6a 내지 c에 나타낸 바와 같이, MASP-2-/- 마우스의 혈장은 만난 및 지모
산 피복된 플레이트 상의 렉틴-경로-매개 보체 활성화 내의 완전 결핍이다. 이러한 결과는 MASP- 또는 MASP-3
이 아닌, MASP-2가 렉틴 경로의 효과기 성분이라는 것을 분명하게 입증하였다.
C3b 침착 측정법:
1) Nunc Maxisorb 마이크로리터 플레이트 (Maxisorb, Nunc, Cat. No. 442404, Fisher Scientific)를 1㎍/㎖
만난 (M7504 Sigma) 또는 피복 완충액 (15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, pH 9.6)으로 희석된 모든 다른 리간드
(예컨대, 예컨대 하기 열거된 것)로 피복시켰다.
2) 잔여 단백질 결합 부위를 1-3 시간 동안 0.1% HSA-TBS 차단 완충액 (0.1% (w/v) HSA의 10 mM Tris-CL용액,
140 mM NaCl, 1.5 mM NaN3, pH 7.4)으로 배양된 플레이트에 의하여 포화시켰다.
++ (
*3) 플레이트를 TBS/tw/Ca TBS, 0.05% Tween 20 및 5 mM CaCl2)로 세척하였으며, 희석된 BBS를 혈청 시료 (4
mM 바르비톨, 145 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH 7.4)에 첨가하였다. 완충액을 넣은 웰은 음성 대조군
로서 사용하였다. 야생형 또는 MASP-2-/- 마우스에서 획득한 대조군 세트의 혈청 시료는 측정에 사용되기 전
에 C1q가 결핍되었다. C1q-결핍 마우스 혈청은 제조자의 지시에 따라 레빗 항-인간 C1q IgG (Dako, Glostrup,
Denmark)로 피복된 단백질-A-커플 다이나비드 (Dynal Biotech, Oslo, Norway)를 사용하여 제조된다.
4) 4℃에서 밤샘 배양 후, TBS/tw/Ca ++
로 세척하였으며, 전환되고 및 결합된 C3는 TBS/tw/Ca ++
를 1:1000로 희
석된 다클론 항-인간-C3c 항체 (Dako A 062)로 검출된다. 2차 항체는 TBS/tw/Ca ++
로 1:10,000 희석된 알카라인
-포스파타아제 (Sigma Immunochemicals A-3812)에 접합된 염소 항-레빗 IgG (전체 분자)이다. 대체 보체 경로
(AP)의 전체는 100㎕ 기질 용액 (시그마 패스트 p-니트로페닐 포스페이트 타블렛 세트, Sigma)의 첨가 및 실
온 배양에 의하여 결정된다. 가수분해는 마이크로리터 플레이트 리더 내에서 450 nm 흡광도를 측정함으로써
정량적으로 모니터링되었다. 표준 곡선은 연속 희석 혈장/혈청 시료를 사용하는 각 분석을 위하여
생성되었다.
결과: 도 7a 및 7b에 나타낸 결과는 수종의 마우스의 풀을 형성한 형청에서 나왔다. 십자는 MASP-2+/+ 혈청을
나타내며, 검은 원은 C1q 결핍 MASP-2+/+ 혈청을, 개방 사각형은 MASP-2-/- 혈청을 나타내고, 개방 삼각은
C1q 결핍 MASP-2-/- 혈청을 나타낸다. 도 7a 내지 b에 나타난 바와 같이, C3b 침착 측정법으로 시험된 MASP-
2-/- 마우스의 혈청은 만난 (도 7a) 및 지모산 (도 7b) 피복 플레이트 상의 낮은 수준의 C3 활성화를 나타낸
다. 이 결과는 MASP-2가 대체 보체 경로를 개시하기 위하여 C3에서 초기 C3b 생성에 기여하는 것이 필요하다
는 것을 분명하게 입증한다. 이는 보체 인자 C3, 인자 B, 인자 D 및 프로퍼딘이 비의존성 기능성 대체 경로를
형성한다는 일반적인 관점에서 놀라운 결과이며, C3는 활성화 표면 예컨대 지모산상에 유체상 전환효소 iC3Bb
및 침착C3b 분자를 생성하는 "C3b-유사" 형태로의 자발적 입체구조 변화를 겪게된다.
재조합 MASP-2는 MASP-2-/- 마우스 혈청 내의 렉틴 경로-의존성 C4 활성화를 재구성한다
MASP-2의 부재가 MASP-2-/- 마우스 내의 렉틴 경로-의존성 C4 활성화 손실의 직접적 원인이라는 사실을 확립
하기 위하여, 재조합 MASP-2 단백질을 혈청 시료에 첨가한 효과는 전술한 C4 분열 측정법으로 조사되었다. 기
능적으로 활성인 뮤린 MASP-2 및 촉매적으로 불활성인 뮤린 MASP-2A (세린 프로테아제 도메인 내의 활성-부위
세린 잔기는 알라닌 잔기로 치환) 재조합 단백질을 생산하였으며, 실시예 5에서와 같이 정제하였다. 4 MASP-2
-/- 마우스의 풀을 형성한 혈청을 재조합 뮤린 MASP-2 또는 불활성 재조합 뮤린 MASP-2A의 단백질 농도를 증
가시켜 사전 배양하였으며, C4 전환효소 활성을 전술한 바와 같이 측정하였다.
결과: 도 8에 나타낸 바와 같이, 기능적으로 활성인 뮤린 재조합 MASP-2 단백질 (개방 삼각형 표지)을 MASP-2
-/- 마우스의 혈청에 첨가하여 단백질 농도 의존성 방식 내에서 렉틴 경로-의존성 C4 활성화를 복구하였으며,
여기서, 촉매적으로 불활성인 뮤린 MASP-2A 단백질 (별 표지)은 C4 활성화를 복구하지 못하였다. 도 8의 결과
는 풀을 형성한 야생형 마우스 혈청 (점선 표지)으로 관찰된 C4 활성화에 대하여 정상화되었다.
실시예 3
이 실시예는 뮤린 MASP-2-/-, MApl9+/+ 이거나, 인간 MASP-2 삽입유전자를 발현하는 유전자삽입 마우스 주의
생성을 설명한다 (뮤린 MASP-2 넉-아웃 및 인간 MASP-2 넉-인).
- 65 -
공개특허 10-2012-0099680