(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

[0660]
[0661]
[0662]
[0663]
[0664]
[0665]
[0666]
드루젠, 지도형 위축, 및 콜로이드성 신생혈관형성 (CNV)을 포함한다. 2004년 12월, FDA는 마쿠겐 (Macugen,
pegaptanib)을 습윤 (신생혈관)형 AMD의 치료를 위하여 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 효과에 특이적으로 표
적화하고, 차단하는 새로운 클래스의 안과적 약물로서 승인하였다 (Ng et al., Nat Rev. Drug Discov 5:123-
32 (2006)). 마쿠겐이 AMD 환자의 아군에 전도유망한 치료효과를 나타냄에도, 이 복합체 질환의 추가의 치료
를 개발하기 위한 시도가 존재한다. 다중, 비의존성의 연구는 AMD 발병기전 내의 보체 활성화의 중추적 역할
에 관한 것이다. 가장 심각한 형태의 AMD인 콜로이드성 신생혈관형성 (CNV)의 발병기전은 보체 경로의 활성화
에 관한 것이다.
25년 전, 라이언은 동물 내의 CNV의 레이저-유도 손상 모델을 설명하였다 (Ryan, S.J., Tr. Am. Opth. Soc.
LXXVII-JOl -145, 1979). 이 모델은 초기에 리저스 원숭이를 사용하여 발전되었으나, 동일한 기술이 다양한
연구 동물, 예컨대 마우스의 유사한 CNV 모델을 개발하는데 사용되고 있다 (Tobe et al., Am. J. Pathol.
753:1641-46, 1998). 이 모델에서, 레이저 광응고가 CNV-유사 막의 형성이 되는 브런치 막의 파열에 사용되었
다. 레이저-유도 모델은 다수의 중요한 인간 증상의 특징을 잡아내었다 (Ambati et al., Survey
Ophthalmology 48:257-293, 2003). 레이저-유도 마우스 모델은 현재 잘 확립된 바, 대형 연구 프로젝트의 실
험 베이스로 사용된다. 일반적으로 레이저-유도 모델은 인간 CNV와 충분한 생물학적 유사성을 공유하는 것으
로 인식되며, 이 모델을 사용하는 발병기전의 전임상적 연구들 및 약물 억제는 인간 내의 CNV에 관련되어 있
다.
방법:
A MASP-2-/- 마우스는 실시예 1에 설명된 바와 같이 생성되었으며, 10마리의 생성을 위하여 C57B1/6와 역교배
되었다. 현재의 연구는 MASP-2 (-/-) 및 MASP-2 (+/+) 수컷 마우스가 레이저-유도성 CNV의 경과 내에서 평가
되는 경우, 결과를 비교하였으며, 레이저 손상 후 ELISA에 의한 망막 색소 상피 (RPE)/맥락막내의 조직 손상
및 VEGF 수준의 결정, CNV에 관련된 잠재적 혈관형성 인자의 측정으로서 레이저 공초점 현미경 스캐닝에 의하
여 레이저-유도성 CNV의 부피에 집중된 신생혈관 AMD 모델을 가속화하였다.
콜로이드성 신생혈관형성 (CNV)의 유도: 약물군 정렬로 표지된 단일 개체에 의하여 실험 0일에 각 동물의 양
쪽 눈에 레이저 광응고 (532 nm, 200 mW, 100 ms, 75㎛; Oculight GL, Iridex, Mountain View, CA)를 수행하
였다. 스플릿 램프 전달 시스템 및 콘택트 렌즈로서 커버슬립을 사용하여 레이저 스폿을 시신경 주위에 표준
화된 방법으로 가하였다. 레이저 손상의 형태학적 종점은 거품공동화의 외관이었으며, 이 징후는 브루쉬 막의
파괴에 관련된 것으로 보인다. 상세한 방법 및 평가된 종말점은 다음과 같다.
형광안저조영술: 형광안저조영술은 레이저 광응고 일주일 후 카메라 및 영상화 시스템 (TRC 50 IA 카메라;
ImageNet 2.01 System; Topcon, Paramus, NJ)로 수행되었다. 사진은 0.1 ml의 2.5% 형광 나트륨의 복막내 주
사 후 기저 카메라 렌즈에 접촉된 20-D 렌즈로 캡춰되었다. 망막 전문가는 표지된 방법내의 단일 세팅에서 형
광안저조영사진을 평가한 레이저 광응고 또는 혈관조영술에 관여하지 않았다.
콜로이드성 신생혈관형성 (CNV)의 부피: 레이저 손상 일주일 후, 눈을 제핵하고 4% 파라포름알데히드로 30
분간 4℃에서 고정하였다. 세안컵은 앞쪽 부분을 제거하여 얻었으며, PBS로 3회 세척하였으며, 메탄올 시리즈
를 통하여 탈수 및 재수화를 하였다. 완충액 (PBS, 1% 보빈 혈청알부민 및 0.5% Triton X-100 함유)으로 30
분간 실온에서 2회 차단 후, 세안컵을 내피 세포의 표면상의 말단 β-D-갈락토오스 잔기에 결합하고 및 뮤린
혈관계를 선택적으로 표지하는 0.2% BSA 및 0.1% Triton X-100을 함유한 PBS로 희석된 0.5% FITC-이소렉틴 B4
(Vector laboratories, Burlingame, CA)으로 4℃에서 배양하였다. 0.1% Triton X-100 함유 PBS로 2회 세척
후, 신경감각 망막을 서서히 탈거하고 안신경으로부터 제거하였다. 4회의 릴렉싱 라디칼 절개를 하였으며, 및
잔존 RPE-맥락막-공막 복합체를 안티페이드 배지 (Immu-Mount Vectashield Mounting Medium; Vector
Laboratories)에 안착시키고 커버를 덮었다.
안착된 것들을 스캐닝 레이저 공초점 현미경 (TCS SP; Leica, Heidelberg, Germany)으로 조사하였다. 혈관은
블루 아르곤 파장 (488 nm)으로 여기시켜 가시화하였으며, 515와 545 nm 사이의 방출을 캡춰하였다. 40X 오일
-침지 오브젝트가 영상화 연구들에 사용되었다. 수평 광학 섹션 (lμm 단계)는 RPE-맥락막-공막 복합체의 표
면에서 획득하였다. 병변에 연결된 주변 콜로이드성 혈관 네트워크를 확인할 수 있는 최심도 초점 평면은 병
변의 바닥으로 결정되었다. 레이저-표적화 영역내의 모든 혈관및 이 참조 평면의 외관은 CNV로 결정되었다.
각 섹션의 영상은 디지털로 저장되었다. CNV-유관 형광 영역은 현미경 소프트웨어 (TCS SP; Leica)으로 컴퓨
터 영상 분석하여 측정하였다. 각 수평 섹션 내의 형광 영역의 총합은 CNV 부피의 지표로서 사용되었다. 영상
화는 치료군으로 지정한 작업자에 의하여 수행되었다.
- 86 -
공개특허 10-2012-0099680