(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

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에 의해 설명된 바와 같이 쥐 허혈/재관류 (MIRP) 모델에서 비교하였다.
방법:
이 연구에 사용된 MASP-2 (-/-) 마우스는 실시예 27에서 설명한 바와 같이 생성되었다. 실시예 27에서 설명된
방법을 사용하여 좌심실 허혈성 손상을 8마리 야생형 (MASP-2 (+/+)) 및 11마리 MASP-2 (-/-) 마우스에 수행
하였다. 경색 부피 (INF) 및 위험영역 (AAR)은 실시예 27에 설명된 바와 같이 플라노메트리에 의해 결정하였
다.
랑겐도르프 분리-관류 마우스 심장 모델: 랑겐도르프 분리-관류 마우스 심장 모델에 대해 마우스로부터 심장
을 준비하는 방법은 F.J. Sutherland et al., Pharmacol Res 41: 613 (2000)에 설명된 바와 같이 수행되었다.
또한 A.M. Kabir et al,. Am J Physiol Heart Circ Physiol 291: H1893 (2006); Y. Nishino et al., Circ Res
103:307 (2008) 및 I.G. Webb et al., Cardiovasc Res (2010)) 참조.
간단히 설명하자면, 6마리 수컷 야생형 (+/+) 및 9마리 암컷 MASP-2 (-/-) 마우스를 펜토바비탈 (300 mg/kg)
및 헤파린 (150 유닛)을 복강 내 주사하여 마취시켰다. 심장을 신속하게 분리하고 빙냉 변형된 크렙스-헨셀리
트 완충액 (KH, 118.5 mmol/l NaCl, 25.0 mmol/l NaHCO3, 4.75 mmol KCl, KH2PO4 1.18, MgSO41.19, D-글루코스
11.0, 및 CaCl2 1.41)에 넣어두었다. 잘라진 심장은 물 자켓이 있는 랑겐도르프 장치에 올려졌고 80 mm Hg의
일정한 압력에서 95% O2 및 5% CO2로 평형화된 KH 완충액으로 역으로 관류하였다. 관류액의 온도는 37℃로 유
지되었다. 좌심실에 삽입된 액체로 가득 찬 풍선은 수축성 기능을 관찰하였다. 풍선은 끝-확장기 혈압이 1 내
지 7 mm Hg 일 때까지 점점 부풀었다. 심방의 보측은 580 bpm에서 0.075-mm 은선 (Advent)으로 수행되었다.
관상동맥 혈류를 정기적인 관류액의 수집에 의해 측정하였다.
시험관 내에서 경색 평가
역 관류가 시작된 후, 심장을 30분 동안 안정화시켰다. 인클루젼을 위해, 모든 심장은 다음 기준에 따라 실행
되어야 했다: 관상동맥의 흐름은 1.5 내지 4.5 ml/min, 심장 박동수는 300 bpm 초과 (미보측), 좌심실 전개된
압력 55 mm Hg 초과, 개흉부터 대동맥 캐뉼러 삽입까지 시간은 3 분 미만, 및 안정화 도중 끊임없는 율동부정
없음. 전신 허혈 및 재관류는 혈청 없이 행해졌다. 다음에 모든 심장을 대동맥 유입 튜브를 조임으로써 30분
의 전신 허혈을 겪게 하였고, 이어서 2 시간의 재관류를 하였다.
허혈 중 수축이 멈추었을 때, 전기적 보측을 중지하고 30분 후 다시 시작하고 재관류하였다. 2 시간의 재관류
후, KH 중의 1% 트리페닐 테트라졸리움 클로라이드 (TTC) 5ml로 1분간 관류한 다음 37℃에서 10 분 동안 동일
한 용액에 넣어두었다. 다음에 심방을 제거하였고, 심장을 건조하게 닦아내고, 무게를 재고, -20 ℃에서 1 주
일간 보관하였다.
그 다음 심장을 해동하고, 2.5% 글루타르알데히드에 1 분 동안 두었고, 및 5% 아가로즈에 고정시켰다. 다음에
아가로즈 심장 블록을 비브라톰 (Agar Scientific)을 사용하여 0.7 mm 두께의 슬라이스로 꼭대기부터 바닥으
로 섹션했다. 섹션 후, 슬라이스를 4℃에서 추가로 하루 동안 PBS에 옮겨지기 전에 상온에서 10% 포름알데히
드에 밤새 두었다. 섹션을 그 다음 퍼스펙스 판 사이 (0.57 mm 간격)에서 압축시키고 스캐너 (Epson 모델
G850A)를 사용하여 이미지화하였다. 확대 후, 이미지 분석 소프트웨어 (SigmaScan Pro 5.0, SPSS)를 사용하여
플라니메트리를 수행하고 전체, TTC-음성, 좌심실 심방근의 표면적을 조직 두께로 곱해서 부피로 변환하였다.
각 심장 내에서, 각 슬라이스를 합한 후, TTC-음성 경색 부피를 좌심실 부피에 대한 퍼센트로 표시하거나 도
표화하였다.
결과:
경색 면적의 크기 (연한 색), 좌심실 (LV) 위험영역 (빨강) 및 정상적으로 관류된 좌심실 지역 (파랑)을 그들
의 색상 외관 및 색상 경계를 확인함에 의해 각 섹션으로 개괄하였다. 영역을 조사자가 각 슬라이드의 양 가
장자리에 대해 정량하고 평균화하였다. 경색 부피는 각 동물에 대해 위험영역 % (% RZ)로서 계산된다.
도 31a는 상기 설명된 관상동맥 동맥 폐색 및 재관류 기술을 수행한 후 그들의 경색 부피를 결정하기 위한 8
마리 야생형 (+/+) 마우스 및 11마리 MASP-2 (-/-) 마우스의 평가를 나타낸다. 도 31a는 평균 위험영역 (AAR,
허혈에 의해 영향을 받은 영역의 척도) 및 경색 부피 (INF, 심근의 손상의 척도)를 전체 심근 부피의 백분율
로서 그래프로 예시한다. 도 31a에서 보여준 것과 같이, 두 그룹 사이의 AAR에서 차이는 없지만, 반면에 INF
부피는 야생형 한배새끼와 비교하여 MASP-2 (-/-) 마우스에서 상당히 감소되었고, 따라서 이 MIRP 모델에서
MASP-2가 없을 때 심근의 손상으로부터 보호 효과를 가리킨다.
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공개특허 10-2012-0099680