(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

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는 Fab2)는 선재하는 C3 전환효소의 활성을 직접적으로 억제하지 못한다. 그러나, MASP-2 세린 프로테아제 활
성은 렉틴 경로 C3 전환효소를 포함하는 두 단백질 성분 (C4b, C2a)의 생성을 위하여 필요하다. 따라서,
MASP-2 기능성 활성을 억제 (즉, 항-MASP-2 Fab2 차단)하는 항-MASP-2 Fab2는 렉틴 경로 C3 전환효소의 새로
운 형성을 억제한다. C3는 이의 구조의 일부로서 특이적이고 고 반응성인 티오에스테르기를 함유한다. 이 측
정법 내의 C3 by C3 전환효소의 분열에 있어서, C3b상의 티오에스테르기는 에스테르 또는 아미드 결합을 통하
여 플라스틱 웰의 바닥에 고정된 마크로분자상에서 히드록실 또는 아미노기와 공유 결합을 형성할 수 있다,
따라서 ELISA 측정법에서 C3b의 검출을 촉진하게 된다.
효모 만난은 렉틴 경로의 공지된 활성제이다. C3 전환효소의 형성을 측정하는 다음의 방법에서, 만난으로 피
복된 플라스틱 웰을 렉틴 경로를 활성화시키기 위하여 희석된 래트 혈청과 함께 37℃로 30 분간 배양하였다.
그 다음 웰을 세척하고, 웰상에 고정된 C3b를 표준 ELISA법을 사용하여 측정하였다. 이 측정법에서 생성된
C3b의 양은 렉틴 경로 C3 전환효소의 새로운 형성을 직접 반영한다. 선택된 농도에서의 항-MASP-2 Fab2s가 이
들의 C3 전환효소 형성 및 결과적인 C3b 생성의 억제하는 능력에 대한 이 측정법에서 시험되었다.
방법:
96-웰 코스타 배지 결합 플레이트를 50 mM 카보네이트 완충액 (pH 9.5)으로 희석된 만난으로, 1 ug/50㎕/웰에
서 5℃로 밤샘 배양하였다. 밤샘 배양 후, 각 웰은 200 ㎕ PBS로 3회 세척하였다. 웰을 100 ㎕/웰의 1% 보빈
혈청 알부민의 PBS 용액으로 차단시키고, 온건 혼합으로 실온에서 1시간 동안 배양 하였다. 각 웰을 200 ㎕의
PBS로 3회 세척하였다. 항-MASP-2 Fab2 시료를 선택된 농도의 Ca ++
및 Mg ++
함유 GVB 완충액 (4.O mM
바르비탈, 141 mM NaCl, 1.O mM MgCl2, 2.0 mM CaCl2, 0.1% 젤라틴, pH 7.4)으로 5℃로 희석하였다. 0.5% 래트
혈청을 상기 시료에 5℃로 첨가하였으며 100 ㎕을 각 웰에 이동시켰다. 플레이트를 덮고, 37℃에서 30분간 수
조에서 배양하여 보체 활성화를 가능하게 하였다. 반응은 37℃ 수조의 플레이트를 얼음-물 혼합물 용기에 이
동시켜 중단시켰다. 각 웰은 200 ㎕의 PBS-Tween 20 (0.05% Tween 20의 PBS 용액)으로 5회 세척하고, 그 다음
200 ㎕의 PBS로 2회 세척하였다. 100 ㎕/웰 의 1:10,000 희석 1차 항체 (레빗 항-인간 C3c, DAKO A0062)를
2.0 mg/㎖ 보빈 혈청 알부민을 함유한 PBS에 첨가하였으며, 온건 혼합하면서 실온에서 1시간 배양하였다. 각
웰을 200 ㎕ PBS로 5회 세척하였다. 100 ㎕/웰의 1:10,000 희석 2차 항체 (과산화효소-접합 염소 항-레빗
IgG, American Qualex A102PU)를 2.0 mg/㎖의 보빈 혈청 알부민을 함유한 PBS에 첨가하였으며, 진탕기에서 온
건 혼합하면서 실온에서 1시간 배양하였다. 각 웰을 200 ㎕의 PBS로 5회 세척하였다. 100 ㎕/웰의 과산화효소
기질 TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories)을 첨가하고, 실온에서 10분간 배양하였다. 과산화효소 반응은
100 ㎕/웰의 1.0 M H3PO4 를 첨가하여 중단시키고, OD450 을 측정하였다.
2. MASP-2-의존성 C4 분열의 억제를 측정하는 측정법
배경: MASP-2의 세린 프로테아제 활성은 고도로 특이적이며, MASP-2의 두 단백질 기질만이 획인되었다; C2 및
C4. C4 분열은 C4a 및 C4b를 생성한다. 항-MASP-2 Fab2는 C4 분열에 직접 관계된 MASP-2상의 구조 에피토프에
결합할 수 있으며 (예컨대, C4의 MASP-2 결합 부위; MASP-2 세린 프로테아제 촉매성 부위), 따라서 MASP-2의
C4 분열 기능성 활성을 억제한다.
효모 만난은 렉틴 경로의 공지된 활성제이다. MASP-2의 C4 분열 활성을 측정하기 위한 다음의 방법에서, 렉틴
경로를 활성화하기 위하여 만난으로 피복된 플라스틱 웰을 희석된 래트 혈청으로 37℃로 30분간 배양하였다.
이 ELISA 측정법에 사용된 1차 항체 인간 C4만을 인식하기 때문에, 희석된 래트 혈청은 인간 C4 (1.0 ㎍/㎖)
로 보충되었다. 그 다음 웰을 세척하고, 표준 ELISA법을 사용한 웰상에 고정된 인간 C4b를 고정하였다. 이 측
정법의 생성된 C4b의 양은 MASP-2 의존성 C4 분열 활성의 측정치이다. 선택된 농도에서의 항-MASP-2 Fab2는
C4 분열의 억제하는 이들의 능력에 대하여 이 측정법에서 시험되었다.
방법: 96-웰 코스타 배지 결합 플레이트를 1.0 ㎍/50 ㎕/웰에서 50 mM 카보네이트 완충액으로 희석된 만난
(pH 9.5)으로 5℃에서 밤샘 배양하였다. 각 웰을 200 ㎕ PBS로 3회 세척하였다. 웰을 100 ㎕/웰의 1% 보빈 혈
청 알부민의 PBS용액으로 차단시켰으며 온건 혼합하면서 실온에서 1시간 배양하였다. 각 웰을 200 ㎕의 PBS로
3회 세척하였다. 항-MASP-2 Fab2 시료를 선택된 농도의 Ca ++
및 Mg ++
공개특허 10-2012-0099680
함유 GVB 완충액 (4.0 mM 바르비탈, 141
mM NaCl, 1.0 mM MgCl2, 2.0 mM CaCl2, 0.1% 젤라틴, pH 7.4)으로 5℃에서 희석하였다. 1.0 ㎍/㎖ 인간 C4
(Quidel)를 이러한 시료 내에 첨가하였다. 0.5% 래트 혈청을 5℃에서 상기 시료에 첨가하였으며, 100 ㎕를 각
웰에 이동시켰다. 플레이트를 덮고, 37℃로 30분간 배양하하여 보체 활성화를 가능하게 하였다. 반응은 37℃
수조의 플레이트를 얼음-물 혼합물 용기에 이동시켜 중단시켰다. 각 웰은 200 ㎕의 PBS-Tween 20 (0.05%
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