(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

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트위저는 심장에 닿지않게 흉골방향으로 흉막 뒤에 조심스럽게 두었으며, 흉막 및 늑간 근육을 전동 절제기로
절제하였다 (Harvard Apparatus, UK). 출혈을 막기 위하여 특별관리를 하였다. 동일한 기법을 사용하여, 개흉
술을 중앙 겨드랑이 선까지 확장하였다. 4번 갈비뼈를 제거한 후, 늑간 공간을 전체 심장이 노출될 때까지 확
장시켰다. 두 개의 작은 동맥 겸자로 심낭막을 개방하고, 심낭막 받침을 심장 약간 앞쪽으로 이동시켰다. 좌
측 전단 하행 심장동맥 (LAD)을 노출시키고, 8-0 모노필라멘트 봉합사와 라운드형 바늘로 LAD 밑을 통과시켰
다. LAD 결찰 부위는 좌심방의의 상부의 꼬리쪽에 있으며, 약 1/4의 라인은 방실 능선에서 좌심실의 끝까지
이어진다.
모든 실험은 맹검으로 실시하였으며, 실험자는 각 동물의 유전형을 인식하지 못하였다. 기기조작 및 외과적
과정을 마친 후, 마우스에 15 분의 평형형성 기간을 주었다. 그 다음 마우스에게 30 분의 심장동맥 폐색과
120 분의 재관류를 하였다.
심장동맥 폐색 및 재관류 모델
심장동맥 폐색은 전술한 체중 달기 시스템을 사용하여 달성되었다 (Eckle et al., Am J Physiol Heart Circ
Physiol 291 :H2533-H2540, 2006). 모노필라멘트 결찰의 두 말단은 2 mm 길이의 폴리텐 PE-10 튜브 단편을 통
과시켰으며, 시아노아크릴레이트 아교를 사용하여 5-0 봉합 길이에 침착되었다. 봉합은 두 수평 장착 이동식
로드에 연결되며, 각 질량 1 g이 봉합 양 말단에 침착되었다. 로드를 올림에 따라, 질량추가 현수되며, 봉합
부위가 압력을 받아 정의된 LAD 및 일정한 압력을 받게된다. LAD 폐색은 위험 영역의 창백성에 의하여 입증되
며, LAD 관류 영역의 색은 밝은 적색에서 자색으로 변화하고, 이는 혈류의 중단을 의미한다. 재관류는 질량추
가 시술 패드에 오고 결찰부 압력이 경감될 때까지 로드를 낮추어 달성된다. 재관류는 폐색을 입증하는데 사
용되는 동일한 3 기준에 의하여 입증된다. 모든 3 기준이 심장동맥 폐색의 개시 또는 각각 15분의 재관류에서
일치하지 않으면 마우스는 추가의 분석에서 배제된다. 심장동맥 폐색시, 심장 표면의 온도 및 습도는 소흉근
플랩으로 심장을 덮고, 0.9% 식염수 습식 거즈에 의한 개흉 밀봉에 의하여 유지된다.
심근 경색 부피의 측정:
경색 부피 (INF) 및 위험 영역 (AAR)은 플라노메트리 (planometry)에 의하여 측정된다. 500 LU. 헤어핀의
i.v. 주사 후, LAD는 재폐색되고, 위험영역 (AAR)을 보여주기 위하여 300㎕의 5% (w/vol) 에반스 블루
(Sigma-Aldrich, Poole, UK)를 목 정맥에 서서히 주입하였다. 이는 좌심실의 비-허혈 영역에 염료가 진입하는
원인이 되며, 허혈 AAR는 미염색된 채로 남게된다. 경추 탈구로 마우스를 희생시킨 후, 심장을 신속하게 제거
한다. 심장을 얼음에서 냉각시키고, 5% 아가로스의 차단에 장착하고, 그 다음 800μm 두께의 8단편의 횡단면
으로 자른다. 모든 슬라이스를 37℃에서 20분간, 0.1 M Na2HPO4/NaH2PO4 완충액 (pH 7.4)에 용해된 3% 2,3,5-
트리페닐테트라졸륨 클로라이드 (Sigma Aldrich, Poole, UK)로 배양하였다. 슬라이스를 10% 포름알데히드 내
에서 밤샘하여 고정하였다. 슬라이스를 두 커버 슬릿 사이에 두고, 고해상도 광학 스캐너를 사용하여, 각 슬
라이스의 측면을 디지탈 영상화하였다. 디지탈 영상을 SigmaScan 소프트웨어 (SPSS, US)를 사용하여 분석하였
다. 경색된 영역 (창백), 좌심실 (LV) 위험영역 (적색) 및 정상적 관류 LV 영역 (청색)의 크기가 외관 색 및
색 경계의 확인에 의하여 각 섹션에서 개략되었다. 영역은 각 슬라이스의 양 측면에서 정량화되었으며, 조사
자에 의하여 평균처리되었다. 경색 부피는 각 동물의 위험 영역의 %로 계산되었다.
결과: 경색된 영역 (창백), LV 위험영역 (적색) 및 정상 관류 LV 영역 (청색)의 크기가 외관 색 및 색 경계의
확인에 의하여 각 섹션에서 개략되었다. 영역은 각 슬라이스의 양 측면에서 정량화되었으며, 조사자에 의하여
평균처리되었다. 경색 부피는 각 동물의 위험 영역의 %로 계산되었다. 도 16a는 전술한 심장동맥 폐색 및 재
관류 기법을 시술한 후 이들의 경색 부피를 결정하기 위한 7마리의 WT (+/+) 마우스 및 7마리의 MASP-2 (-/-)
마우스의 평가를 나타낸다. 도 16a에 나타낸 바와 같이, MASP-2 (-/-) 마우스는 야생형 (+/+) 마우스에 비하
여 경색 부피에 있어서 통계학적으로 현저한 감소 (p