(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

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등)로 또는 없이 0일 및 2일에 획득하였다. 정상 마우스 군은 혈청 주사 2일 전 MASP-2 억제제로 선처리되었
다. 추가의 마우스 군은 0일에 혈청 주사를 맞았고, 6일차에 MASP-2 억제제를 맞았다. 임상적 지표는 시간에
따라 각 영향받은 발에 1 포인트, 살짝 부풀어오른 것에 1/2 포인트를 부여하였다. 발목 두께를 캘리퍼스로
측정하였다 (두께는 0일에서의 두께와의 차이로 정의되었다).
실시예 16
이 실시예는 인간 혈장으로 관류된 레빗 심장의 생체 외 모델 내에서 보체- 매개 조직 손상의 억제 측정법을
설명한다.
배경 및 이론적 근거: 보체 시스템의 활성화는 이종이식편의 초급성 거부반응에 기여한다. 이전의 연구들은
초급성 거부반응은 대체 경로의 활성화를 통한 항-공여자 항체의 부재에서 발생할 수 있다는 것을 보여준다
(Johnston, P.S., et al., Transplant Proc. 23:877-879, 1991).
방법: 분리된 항-MASP-2 억제제 예컨대 항-MASP-2 항체 (실시예 7)가 조직 손상 내의 보체 경로를 억제할 수
있는지를 결정하기 위하여, 항-MASP-2 MoAbs 및 항체 단편을 희석한 인간 혈장으로 관류된 분리된 레빗 심장
의 생체 외 모델 내을 사용하여 시험하였다. 이 모델은 대체 보체 경로를 활성화시킴으로써 레빗 심근에 손상
을 유발한다고 사전에 알려졌다 (Gralinski, M.R., et al., Immunopharmacology 34:79-88, 1996).
실시예 17
이 실시예는 본 발명의 방법에 따라 렉틴-의존성 경로에 관련된 증상의 치료를 위하여 MASP-2 억제제의 효과
적인 투약량을 측정하기에 유용한 호중구 활성화를 측정하는 측정법을 설명한다.
방법: 호중구 엘라스테라아제의 측정 방법은 Gupta-Bansal, R., et al., Molecular Immunol. 37:191-201,
2000에 설명되어있다. 요약하자면, 엘라스테라아제와 혈청 αl-안티트립신의 복합체는 엘라스테라아제 및 α
l-안티트립신 모두에 대한 항체를 사용하는 두-부위 샌드위치 측정법으로 측정된다. 폴리스티렌 마이크로리터
플레이트는 1:500으로 희석된 항-인간 엘라스테라아제 항체 (결합 부위, Birmingham, UK)의 PBS 용액으로 4℃
에서 피복된다. 항체 용액을 흡인한 후, 웰은 0.4% HAS를 함유한 PBS로 2시간 동안 실온에서 차단되었다.
MASP-2 억제제로 처리되거나, 처리되지 않은 혈장 시료의 분취물 (100 ㎕)을 웰에 첨가하였다. 실온의 2 시간
배양 후, 웰을 PBS로 철저히 헹구었다. 결합된 엘라스테라아제-αl-안티트립신 복합체는 1 시간의 실온 배양
을 하는 1:500으로 희석된 과산화효소 접합-αl-안티트립신 항체의 차단 용액의 첨가로 검출된다. PBS로 플레
이트를 세척한 후, 100 ㎕의 TMB 기질 분취물을 첨가하였다. TMB의 반응은 100 ㎕의 인산의 첨가로 중단되었
으며, 플레이트를 마이크로플레이트 리더내에서 450 nm를 읽었다.
실시예 18
이 실시예는 심근 허혈/재관류를 치료하는데 유용한 MASP-2 억제제를 시험하기 위한 동물 모델을 설명한다.
방법: 심근 허혈-재관류 모델은 Vakeva et al., Circulation 97:2259-2267, 1998, 및 Jordan et al.,
Circulation 104 (12):1413-1418, 2001에 설명되어 있다. 설명된 모델은 MASP-2-/- 및 MASP-2+/+ 마우스에 사
용되기 위하여 다음과 같이 변형되었다. 요약하자면, 성인 수컷 마우스를 마취시키고. 목 정맥 및 장기에 캐
뉼러를 삽입하고, 호흡은 설치류 인공호흡기로 3.5% 내지 5% 사이의 CO2를 배출하도록 조절하면서 100% 산소
를 유지하였다. 좌측 개흉술을 시도하였으며, 봉합은 좌 심장동맥의 기원에서 3 내지 4 mm에 두었다. 허혈 5
분 전, 동물에 MASP-2 억제제, 예컨대 항-MASP-2 항체 (예컨대, 투약 범위는 .01 내지 10 mg/kg 사이)을 투여
하였다. 허혈은 심장동맥을 둘러싼 봉합사를 조임으로써 시작되었으며, 30 분간 유지하였고, 4 시간의 재관류
를 하였다. 봉합사 조임을 제외하고 동일한 샴-수술 동물을 준비하였다.
보체 C3 침착의 분석: 재관류 후, 면역조직화학을 위한 시료는 좌심실의 중앙 영역에서 얻어, 고정시키고, 가
공 전까지 -80℃로 냉동하였다. 조직 섹션을 HRP-접합 염소 항-래트 C3 항체와 함께 배양하였다. 생체 내 C3
침착을 감소시키는 MASP-2 억제제를 확인하기 위하여 조직 섹션을 항-MASP-2 억제제의 존재하에 C3 염색의 존
재를 샴-수술 대조군 동물 및 MASP-2-/- 동물과 비교하여 분석하였다.
실시예 19
이 실시예는 MASP-2 억제제가 이식된 조직이 허혈/재관류 손상되는 것으로부터 보호하는 능력을 시험하는 동
물 모델로서 MASP-2-/- 균주의 사용을 설명한다.
공개특허 10-2012-0099680
배경/이론적 근거: 허혈/재관류 손상은 이식중 공여자 장기 내에서 발생한다고 알려져 있다. 다양한 허혈 모
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