(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

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[0482]
SEQ ID NO:50
뮤린 MASP-2 cDNA
SEQ ID NO:50
뮤린 MASP-2 cDNA
5'ATGAGGCTACTC
ATCTTCCTGG3'
(SEQ ID NO:60)
mMASP-2_순방
5'CCCCCCCTGCGT
CACCTCTGCAG3'
(SEQ ID NO:62)
mMASP-2_ala_순방
5'TTAGAAATTACTTATTAT
GTTCTCAATCC3'
(SEQ ID NO:63)
mMASP-2_역방
5'CTGCAGAGGTGACGCAG
GGGGGG3'
(SEQ ID NO:61)
mMASP-2_ala_역방
MASP-2의 재조합 진핵세포 발현 및 효소 불활성 마우스, 래트, 및 인간 MASP-2A의 단백질 생산
상기 MASP-2 및 MASP-2A 발현 구조체는 표준 인산 칼슘 전달감염 과정을 사용하여 DXB1 세포 내로 전달감염된
다 (Maniatis et al., 1989). MASP-2A는 무-혈청 배지 내에서 생산되었으며, 제조물이 다른 혈청 단백질에 의
하여 오염되지 않도록 한다. 배지는 융합성 세포로부터 격일로 수확되었다 (총 4회). 재조합 MASP-2A 수준은
3종의 각각은 평균 약 1.5 mg/l의 배양 배지였다.
MASP-2A 단백질 정제: MASP-2A (상기 Ser-Ala 돌연변이)는 MBP-A-아가로스 컬럼상의 친화도 크로마토그래피
에 의하여 정제된다. 이 전략은 추가의 태그를 사용하지 않고 신속한 정제를 가능하게 한다. MASP-2A (100-
200 ml의 배지, 부하 완충액 (50 mM Tris-Cl, pH 7.5, 150 mM NaCl 및 25 mM CaCl2 함유)의 동부피로 희석)를
10 ml의 부하 완충액으로 사전 평형된 MBP-아가로스 친화도 컬럼 (4 ml)에 탑재하였다. 그 다음 10 ml의 추가
의 부하 완충액으로 세척하고, 단백질을 1 ml 분획 (50 mM Tris-Cl, pH 7.5, 1.25 M NaCl 및 10 mM EDTA
함유)내에서 용출시켰다. MASP-2A를 함유한 분획은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의하여 확인되었다.
필요한 경우, MASP-2A를 모노Q 컬럼 (HR 5/5)상의 이온-교환 크로마토그래피에 의하여 추가로 정제하였다. 단
백질을 50 mM Tris-Cl (pH 7.5, 50 mM NaCl 함유)로 투석하고, 동일한 완충액 내에서 평형이된 컬럼에 투여하
였다. 세척 후, 결합된 MASP-2A를 10 ml 이상의 0.05-1 M NaCl 성분으로 용출시켰다.
결과: MASP-2A 단백질의 0.25-0.5 mg 산출은 200 ml의 배지에서 획득하였다. MALDI-MS로 측정한 분자질량
77.5 kDa는 글리코실화에 의하여 미개질 폴리펩티드 (73.5 kDa)의 계산값보다 컸다. 각 N-글리코실화 부위의
글리칸 침착이 관찰된 질량을 설명해준다. MASP-2A는 SDS-폴리아크릴아미드 겔 상의 단일 밴드로서 이동하며,
이는 이들이 생합성 시 단백질분해적으로 가공되지 않는다는 것을 입증한다. 평형 초원심분리에 의하여 측정
된 중량-평균 분자량은 글리코실화 폴리펩티드의 동종이량체의 계산값과 일치한다.
재조합 인간 MASP-2 폴리펩티드의 생산
또 다른 폴리펩티드에서 유도된 재조합 MASP-2 및 MASP2A의 생산 방법은 문헌 Thielens, N.M., et al., J.
Immunol. 166:5068-5077, 2001에 설명되어 있다. 요약하자면, 스포돕테라 프루기페르다 (Spodoptera
frugiperda) 곤충 세포 (Ready-Plaque Sf9 Cell, Novagen, Madison, WI)를 50 IU/㎖ 페니실린 및 50 mg/㎖ 스
트렙토마이신 (Life Technologies)으로 보충된 Sf900II 무-혈청 배지 (Life Technologies)에서 성장 및 유지
시켰다. 트리초플루시아 니 (Trichoplusia ni) (High Five) 곤충 세포 (Jadwiga Chroboczek, Institut de
Biologie Structurale, Grenoble, France)를 50 IU/㎖ 페니실린 및 50 mg/㎖ 스트렙토마이신으로 보충된
TC100 배지 (Life Technologies, 10% FCS (Dominique Dutscher, Brumath, France) 함유) 내에서 유지시켰다.
재조합 바큘로바이러스를 Bac-to-Bac 시스템 (Life Technologies)을 사용하여 생성하였다. bacmid DNA는
Qiagen midiprep 정제 시스템 (Qiagen)을 사용하여 정제하였으며, Sf900II SFM 배지 (Life Technologies) 내
에서 제조자의 지시에 따라 세포펙틴을 사용한 Sf9 곤충 세포 전달감염에 사용하였다. 재조합 바이러스 입자
를 4일 후 수거 하였으며, 바이러스 플라크 측정법으로 역가를 측정하였고, King and Possee, The
Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, Chapman 및 Hall Ltd., London, pp. 111-114, 1992에
의하여 증폭하였다.
하이 파이브 세포 (1.75 x 10 7
세포/175-cm 2
조직 배양 플라스크)는 96시간 동안 28℃의 Sf900II SFM 배지내에
서 감염다중도 2로서 MASP-2 폴리펩티드를 함유한 재조합 바이러스로 감염되었다. 상청액은 원심분리로 수거
되었으며 및 디이소프로필 포스포로플루오리데이트를 첨가하여 최종 농도가 1 mM가 되었다.
공개특허 10-2012-0099680
MASP-2 폴리펩티드가 배양 배지내로 분비된다. 배양 상청액은 50 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 50 mM 트리에탄올아민
하이드로클로라이드, pH 8.1으로 투석되고, 및 loaded at 1.5 ml/min로 동일한 완충액에서 평형인 Q-세파로스
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