(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

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되었다. DNA 서열은 인간 IgG1의 완전한 VH 및 CH1 도메인을 함유하는 것으로 확인되었다. 적합한 효소에 의
한 분해 후, Fd DNA 단편은 발현 벡터 카세트 pSV2dhfr-TUS의 HindIII 및 BamHI 제한 부위에 삽입되어
pSV2dhfrFd를 산출하였다. pSV2 플라스미드는 구득이 가능하며, 다양한 공급원의 DNA 부분으로 구성되어
있다: pBR322 DNA (얇은 줄)는 pBR322 기원의 DNA 복제 (pBR ori) 및 락타마아제 암피실린 내성 유전자 (Am
p)를 포함하며; 넓은 햇칭 및 마크에 의하여 나타나는 SV40 DNA는 SV40 기원의 DNA 복제 (SV40 ori), 초기 프
로모터 (5' dhfr 및 neo 유전자), 및 폴리아데닐화 신호 (3' dhfr 및 neo 유전자)를 포함한다. SV40-유도성
폴리아데닐화 신호 (pA)는 Fd 유전자의 3' 말단에 놓인다.
카파 유전자를 위하여, PCR은 5' 프라이머로서 5'-AAGAAAGCTTGCCGCCACCATGTTCTCACTAGCTCT-3' (SEQ ID NO:46)
및 CK-유도성 3' 프라이머 (51-CGGGATCCTTCTCCCTCTAACACTCT-31 SEQ ID NO:47)를 사용하여 수행된다. DNA 서열
은 완전한 VK 및 인간 CK 영역을 함유하는 것으로 확인된다. 적합한 제한 효소로 분해 후, 카파 DNA 단편은
발현 벡터 카세트 pSV2neo-TUS의 HindIII 및 BamHI 제한 부위에 삽입되어 pSV2neoK를 산출한다. Fd 및 카파
유전자 모두의 발현은 HCMV-유도성 증진제 및 프로모터 성분에 의하여 유도된다. Fd 유전자는 사슬내 이황화
결합에 관여하는 시스테인 아미노산 잔기를 포함하지 않기 때문에, 이 재조합 키메라 Fab는 비-공유적으로 링
크된 중쇄- 및 경쇄를 포함한다. 이 키메라 Fab는 cFab로서 설계되었다.
중쇄 및 경쇄간 이황화 결합을 지닌 재조합 Fab를 획득하기 위하여, 상기 Fd 유전자는 인간 IgG1의 힌지 영역
으로부터 추가의 9 아미노산 (EPKSCDKTH SEQ ID NO:48)의 암호화 서열을 포함하도록 확장되었다. Fd 유전자의
3' 말단의 30 아미노산을 암호화하는 BstEII-BamHI DNA 부분은 확장된 Fd를 암호화하는 DNA 부분으로 대체되
었으며, 그 결과 pSV2dhfrFd/9aa가 된다.
3. 키메라 항-MASP-2 IgG의 발현 및 정제
키메라 항-MASP-2 IgG 분비 세포주를 생성하기 위하여, NSO 세포가 전기천공에 의하여 정제된 플라스미드
DNAs의 pSV2neoVH-huC.γl 및 pSV2neoV-huC 카파로 전달감염되었다. 전달감염 세포는 0.7 mg/㎖ G418의 존재
로 선택되었다. 세포는 혈청-함유 배지를 사용하여 250 ml 스핀너 플라스크 내에서 성장하였다. 100 ml 스피
너 배양액의 배양 상청액을 10-ml PROSEP-A 컬럼 (Bioprocessing, Inc., Princeton, N. J.)에 투여하였다. 컬
럼을 10 bed 부피의 PBS로 세척하였다. 결합된 항체는 50 mM 시트레이트 완충액, pH 3.0으로 용출되었다. 동
부피의 1 M Hepes, pH 8.0이 정제된 항체를 함유한 분획에 첨가되어 pH를 7.0으로 조절한다. 잔여 염은 밀리
포어 막 초여과에 의한 PBS로의 완충액 교환에 의하여 제거된다 (M.W. 배제: 3,000). 정제된 항체의 단백질
농도는 BCA 법에 의하여 결정된다 (Pierce).
4. 키메라 항-MASP-2 Fab의 발현 및 정제
키메라 항-MASP-2 Fab를 분비하는 세포주의 생성을 위하여, CHO 세포는 전기천공에 의하여 정제된 플라스미드
DNAs의 pSV2dhfrFd (또는 pSV2dhfrFd/9aa) 및 pSV2neo카파로 전달감염되었다. 전달감염 세포는 G418 및 메토
트렉세이트의 존재로 선택되었다. 선택된 세포주는 메토트렉세이트의 증가된 농도를 증폭시켰다. 세포는 제한
희석에 의하여 서브클론된 단일-세포이다. 고-생산 단일-세포 서브클론된 세포주는 그 다음 100 ml 스핀너 배
양에서 무-혈청 배지를 사용하여 성장된다.
키메라 항-MASP-2 Fab는 MASP-2 MoAb에 대한 마우스 항-이디오타입 MoAb을 사용한 친화도 크로마토그래피에
의하여 정제된다. 항-이디오타입 MASP-2 MoAb는 마우스를 열쇄구멍 삿갓조개 헤모시아닌 (KLH)과 접합된 뮤린
항-MASP-2 MoAb로 면역화하고, 인간 MASP-2와 경쟁할 수 있는 특이적 MoAb 결합으로 선별함으로써 제조될 수
있다. 정제를 위하여, cFab 또는 cFab/9aa를 생산하는 CHO 세포의 스핀너 배양물의 100 ml의 상청액을 항-이
디오타입 MASP-2 MoAb과 결합된 친화도 컬럼에 투입하였다. 컬럼은 결합된 Fab가 50 mM 디에틸아민, pH 11.5
으로 용출되기 전에 PBS로 철저하게 세척하였다. 잔여 염은 전술한 완충액 교환으로 제거되었다. 정제된 Fab
의 단백질 농도는 BCA법 (Pierce)에 의하여 결정되었다.
키메라 MASP-2 IgG, cFab, 및 cFAb/9aa가 MASP-2-의존성 보체 경로를 억제하는 능력은 억제 측정법 (실시예
2)을 사용하여 측정할 수 있다.
실시예 11
이 실시예는 L-피콜린/P35, H-피콜린, M-피콜린 또는 만난을 통한 MASP-2-의존성 보체 활성화를 차단할 수 있
는 MASP-2 억제제를 확인하도록 기능성 선별법으로서 시험관 내 C4 분열 측정법을 설명한다.
공개특허 10-2012-0099680
C4 분열 측정법: A C4 분열 측정법은 Petersen, S.V., et al., J. Immunol. Methods 257:107, 2001에 설명되
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