(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

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실시예 25
이 실시예는 실시예 24에 설명한 바와 같이 생성된 수개의 차단 항-래트 MASP-2 Fab2 항체에 대한 에피토프
맵핑을 설명한다.
방법:
도 13에 나타낸 바와 같이, N-말단 6X His 태그를 보유한 모든 다음의 단백질이 pED4 벡터를 사용하여 CHO 세
포 내에서 발현되었다:
알라닌 활성 중심에서 세린의 변화에 의하여 불활성화된 래트 MASP-2A, 전장 MASP-2 단백질 (S613A);
자가활성화를 감소시키도록 변경된 래트 MASP-2K, 전장 MASP-2 단백질 (R424K);
CUBI, EGF-유사 및 CUBII 도메인 만을 함유하는 CUBI-II, 래트 MASP-2의 N-말단 단편; 및
CUBI 및 EGF-유사 도메인 만을 함유하는 CUBI/EGF-유사, 래트 MASP-2의 N-말단 단편.
이러한 단백질은 전술한 바와 같이 니켈-친화도 크로마토그래피에 의하여 배양 상청액으로부터 정제된다
(Chen et al., J. Biol. Chem. 276:25894-02 (2001)).
CCPII 및 래트 MASP-2의 세린 프로테아제 도메인을 함유하는 C-말단 폴리펩티드 (CCPII-SP)가 pTrxFus
(Invitrogen)를 사용하여 티오레독신 융합 단백질로서 이. 콜리 (E. coli)에서 발현되었다. 단백질은 티오밴
드 친화도 수지를 사용하여 세포 용해질에서 정제되었다. 티오레독신 융합 파트너는 음성 대조군로서 빈
pTrxFus에서 발현되었다.
모든 재조합 단백질은 TBS 완충액 내로 투석되었으며 및 이들의 농도는 280 nm의 OD를 측정함으로써 결정되었
다.
도트 블롯 분석:
전술한 5개의 재조합 MASP-2 폴리펩티드 (도 13) (및 CCPII-세린 프로테아제 폴리펩티드에 대한 음성 대조군
로서 티오레독신 폴리펩티드)의 연속 희석으로 니트로셀룰로스 막에 점을 찍었다. 점찍은 단백질의 양은 5배
단계에서 100 ng 내지 6.4 pg의 범위였다. 후의 실험에서, 점찍은 단백질의 양은 다시 5배 단계에서 50 ng 내
지 16 pg의 범위였다. 막을 5% 탈지분유 파우더의 TBS 용액 (차단 완충액)으로 차단하였으며, 그 다음 1.0 ㎍
/㎖ 항-MASP-2 Fab2s의 차단 완충액 (5.0 mM Ca2+ 함유) 용액으로 배양하였다. 결합된 Fab2는 HRP-접합 항-인
간 Fab (AbD/Serotec; 1/10,000 희석) 및 ECL 검출 키트 (Amersham)를 사용하여 검출하였다.
하나의 막을 양성 대조군로서 다클론 레빗-항 인간 MASP-2 Ab와 함께 배양하였다 (Stover et al., J Immunol
163:6848-59 (1999)). 이 경우, 결합된 Ab는 HRP-접합 염소 항-레빗 IgG (Dako; 1/2,000 희석)을 사용하여 검
출하였다.
MASP-2 결합 측정법
ELISA 플레이트는 1.0 ㎍/웰의 재조합 MASP-2A 또는 CUBI-II 폴리펩티드의 카보네이트 완충액 (pH 9.0) 용액
으로 4℃에서 밤샘하여 피복되었다. 웰은 1% BSA의 TBS 용액으로 차단되었으며, 항-MASP-2 Fab2의 연속 희석
물을 5.0 mM Ca2+ 함유 TBS에 첨가한다. 플레이트를 실온에서 1시간 배양하였다. TBS/tween/Ca2+로 3회 세척
후, 1/10,000로 희석된 HRP-접합 항-인간 Fab (AbD/Serotec)의 TBS/Ca2+용액을 첨가하였으며, 플레이트를 추
가적으로 실온에서 1시간 배양하였다. 결합된 항체는 TMB 과산화효소 기질 키트 (Biorad)를 사용하여 검출되
었다.
결과:
Fab2와 다양한 MASP-2 폴리펩티드의 반응을 입증하는 도트 블롯 분석의 결과는 아래 표 7에 나타내었다. 표 7
의 수치값은 신호강도의 절반값을 나타내는데 필요한 점찍힌 단백질의 양을 나타낸다. 나타낸 바와 같이, 모
든 폴리펩티드 (티오레독신 융합 파트너만의 예로로서)는 양성 대조군 Ab에 의하여 인식되었다 (다클론 항-인
간 MASP-2 혈청, 레빗 내에서 린스).
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공개특허 10-2012-0099680