(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

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(Ward, P., Nature Review Immunology VoI 4: 133-142 (2004)). 최근 연구에서는 CLP 동물의 항-C5a 항체 치
료가 세균혈증을 감소시키며, 생존률을 상당하게 향상시킨다는 것을 보여주었다 (Huber-Lang et al., J. of
Immunol. 169: 3223-3231 (2002)). 따라서, MASP-2가 렉틴 및 대체 경로 모두의 개시에서 필수적인 역할을 한
다는 본원의 관찰에 기초하여, CLP 설치류 모델은 패혈증 또는 패혈증 증상 결과의 예방 또는 치료하기위한
치료제로 사용하기에 효과적인 MASP-2 억제제를 선별하기에 유용하다.
방법: CLP 모델은 문헌 Huber-Lang et al., 2004, supra에 설명된 모델로부터 다음과 같이 변형되었다. MASP-
2-/- 및 MASP-2+/+ 동물을 마취시켰다. 2 cm의 중앙 복부 절개를 행하였으며, 맹장을 돌막창지판막아래에서
강하게 결찰하여, 배변 장애를 회피하였다. 맹장은 21-게이지 바늘로 천자되었다. 복부 절개부는 실크 봉합사
및 피부 클립으로 (Ethicon, Summerville, NJ)으로 층 내에서 봉합되었다. CLP 직후, 동물에 MASP-2 억제제
예컨대 항-MASP-2 단클론 항체 (투약량의 범위는 .01 mg/kg 내지 10 mg/kg)의 주사를 투여하였다. 치료제로서
항-hMASP-2 단클론 항체는 MASP-2-/-, hMASP-+/+ 넉-인 CLP 마우스 모델 내에서 쉽게 평가되었다. 마우스의
혈장은 문헌 Huber-Lang et al., 2004, supra에 설명된 측정법을 사용하여 보체-유도성 아나필라톡신 및 호흡
급증의 수준을 분석하였다.
실시예 24
이 실시예는 MASP-2 활성을 차단하는 고친화도 항-MASP-2 Fab2 항체 단편의 확인을 설명한다.
배경 및 이론적 근거: MASP-2는: MBL 및 피콜린의 결합 부위 (들), 세린 프로테아제 촉매성 부위, 단백질분해
기질 C2의 결합 부위, 단백질분해 기질 C4의 결합 부위, MASP-2 효소원의 자가활성화의 MASP-2 분열 부위, 및
두 Ca ++
결합 부위를 포함하는 다수의 별도의 기능성 도메인을 지닌 복합체 단백질이다. Fab2 항체 단편은 고
친화도로 MASP-2에 결합하는 것으로 확인되었으며, 확인된 Fab2 단편은 이들이 MASP-2 기능성 활성을 차단하
는지 여부를 결정하기 위한 기능성 측정법으로 시험되었다.
MASP-2 기능성 활성을 차단하기 위하여, 항체 또는 Fab2 항체 단편은 MASP-2 기능성 활성에 요구되는 MASP-2
상의 구조 에피토프에 결합하거나 이를 방해하여야 한다. 따라서, 이들이 MASP-2 기능성 활성에 직접관계되는
MASP-2 상의 구조 에피토프에 결합하지 않는다면 다수의 또는 모든 고친화도 결합 항-MASP-2 Fab2는 MASP-2
기능성 활성을 억제할 수 없다.
렉틴 경로 C3 전환효소 형성의 억제를 측정하는 기능성 측정법은 항-MASP-2 Fab2s의 "차단 활성"을 평가하기
위하여 사용된다. 렉틴 경로 내의 MASP-2의 1차적 생리학적 역할이 렉틴-매개 보체 경로의 다음 기능성 성분,
즉 렉틴 경로 C3 전환효소를 생성하게 한다는 것이 알려져 있다. 렉틴 경로 C3 전환효소는 단백질분해적으로
C3를 C3a 및 C3b로 분해하는 결정적인 효소적 복합체 (C4bC2a)이다. MASP-2는 렉틴 경로 C3 전환효소
(C4bC2a)의 구조적 성분이 아니다; 그러나, MASP-2 기능성 활성은 렉틴 경로 C3 전환효소를 포함하는 두 단백
질 성분 (C4b, C2a)을 생성하기 위하여 필요하다. 추가적으로, 열거된 MASP-2의 모든 별개의 기능성 활성은
MASP-2가 렉틴 경로 C3 전환효소를 생성하기 위하여 필요한 것 같다. 이러한 이유 때문에, 항-MASP-2 Fab2s의
"차단 활성"을 평가하기에 바람직한 측정법은 렉틴 경로 C3 전환효소 형성의 억제를 측정하는 기능성 측정법
이라고 생각된다.
고친화도 Fab2s의 생성: 선택된 대상 리간드와 반응하는 Fab2s를 확인하기 위한 인간 가변 경쇄 및 중쇄 항체
서열의 파지 디스플레이 라이브러리 및 자동화 항체 선택 기술이 래트 MASP-2 단백질 (SEQ ID NO:55)에 대한
고친화도 Fab2s를 생산하기 위하여 사용된다. 공지의 양의 래트 MASP-2 (~1 mg, >85% 순수) 단백질이 항체 선
별을 위하여 사용된다. 3 라운드의 증폭이 최선의 친화도를 지닌 항체의 선택에 사용된다. 항체 단편을 발현
하는 약 250 개의 다른 히트가 ELISA 선별을 위하여 선택된다. 고친화도 히트는 다른 항체의 유일성을 결정하
기 위하여 후속적으로 서열화된다.
40개의 유일한 항-MASP-2 항체가 정제되며, 하기할 250 ㎍의 각 정제된 Fab2 항체가 MASP-2 결합 친화도 및
보체 경로 기능성 시험의 특성화를 위하여 사용되었다.
항-MASP-2 Fab2s 활성의 억제 (차단)의 평가에 사용되는 측정법
1. 렉틴 경로 C3 전환효소 형성 억제를 측정하기 위한 측정법:
공개특허 10-2012-0099680
배경: 렉틴 경로 C3 전환효소는 단백질분해적으로 C3가 두 잠재적 전염증 단편, 아나필라톡신 C3a 및 옵소닌
C3b로 분해하는 효소적 복합체 (C4bC2a)이다. C3 전환효소의 형성은 염증을 매개하는 렉틴 경로의 핵심 단계
인 것 같다. MASP-2는 렉틴 경로 C3 전환효소 (C4bC2a)의 구조적 성분이 아니다; 따라서 항-MASP-2 항체 (또
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