(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

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고속 흐름 컬럼 (Amersham Pharmacia Biotech) (2.8 x 12 cm)에 투여되었다. 용출은 l.2 리터의 선형 성분을
35O mM NaCl의 동일한 완충액 용액에 도포하여 수행된다. 재조합 MASP-2 폴리펩티드를 함유한 분획은 웨스턴
블롯 분석에 의하여 확인되었으며, (NH4)2SO4를 60% (w/v)까지 첨가하고, 및 밤샘하여 4℃에 놓아 둔다. 펠렛
을 145 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 50 mM 트리에탄올아민 하이드로클로라이드, pH 7.4에 재현탁시키고, 동일한 완
충액에서 평형인 TSK G3000 SWG 컬럼 (7.5 x 600 mm) (Tosohaas, Montgomeryville, PA)상에 적용한다. 정제된
폴리펩티드를 Microsep 미세농축기상의 초여과기법을 사용하여 0.3 mg/㎖로 농축시켰다 (m.w. 배제 = 10,000)
(Filtron, Karlstein, Germany).
실시예 6
이 실시예는 MASP-2 폴리펩티드에 대한 다클론 항체의 생산 방법을 설명한다.
재료 및 방법:
MASP-2 항원: 다클론 항-인간 MASP-2 항혈청은 다음의 분리된 MASP-2 폴리펩티드로 면역화한 레빗에 의하여
생산된다: 혈청에서 분리된 인간 MASP-2 (SEQ ID NO:6) (실시예 4); 재조합 인간 MASP-2 (SEQ ID NO:6), 불활
성 프로테아제 도메인 (SEQ ID NO: 13)을 함유한 MASP-2A (실시예 4-5); 및 재조합 CUBI (SEQ ID NO:8),
CUBEGFI (SEQ ID NO:9), 및 CUBEGFCUBII (SEQ ID NO: 10) (실시예 5).
다클론 항체: 미리 BCG (bacillus Calmette-Guerin vaccine) 접종된 6주령 레빗은 100 ㎍의 MASP-2 폴리펩티
드의 100 ㎍/㎖ 무균 식염수 용액 주사에 의하여 면역화되었다. 주사는 매 4주마다 실시하였으며, 항체 역가
를 ELISA 측정법으로 모니터링하였다 (실시예 7). 배양 상청액은 항체 정제를 위하여 단백질 A 친화도 크로마
토그래피로 수거하였다.
실시예 7
이 실시예는 래트 또는 인간 MASP-2 폴리펩티드에 대한 뮤린 단클론 항체 생산 방법을 설명한다.
재료 및 방법:
8-12 주령 수컷 A/J 마우스 (Harlan, Houston, Tex.)에 완전 프로인트 보조제 (Difco Laboratories, Detroit,
Mich.) 내의 100 ㎍의 인간 또는 래트 rMASP-2 또는 rMASP-2A 폴리펩티드의 200 ㎕의 포스페이트 완충 식염수
(PBS) 용액 (pH 7.4)을 피하주사하였다 (실시예 4 또는 실시예 5와 같음). 2 주 간격으로, 마우스에 불완전
프로인트 보조제 내의 50 ㎍의 인간 또는 래트 rMASP-2 또는 rMASP-2A 폴리펩티드를 2회 피하주사하였다. 4주
차에, 마우스에 50 ㎍의 인간 또는 래트 rMASP-2 또는 rMASP-2A 폴리펩티드의 PBS 용액을 주사하였고, 4일 후
융합하였다.
각각의 융합을 위하여, 단일 세포 현탁액이 면역화된 마우스의 비장에서 제조되었으며, Sp2/0 다발골수종 세
포와의 융합에 사용되었다. 5 x 1O 8
의 Sp2/0 및 5 x 10 8
비장 세포가 50% 폴리에틸렌 글리콜 (M.W. 1450)
(Kodak, Rochester, N.Y.) 및 5% 디메틸설폭사이드 (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.)을 함유한 배지 내
에서 융합되었다. 세포는 10% 보빈 태아 혈청, 100 units/㎖의 페니실린, 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신, 0.1
mM 하이포잔틴, 0.4 μM 아미노프테린 및 16 μM 티미딘으로 보충된 Iscove 배지 (Gibco, Grand Island, N.
Y.)의 200 ㎕의 현탁액 당 1.5 x 10 5
비장 세포의 농도로 조정되었다. 200 마이크로리터의 세포 현탁액을 약
20개의 96-웰 미세배양 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 약 10일 후, 배양 상청액은 ELISA 측정법에서 정제된
인자 MASP-2의 반응성으로 선별하기 위하여 수거하였다.
공개특허 10-2012-0099680
ELISA 측정법: Immulon 2 (Dynatech Laboratories, Chantilly, Va.) 마이크로테스트 플레이트의 웰을 50 ㎕의
정제된 hMASP-2 또는 50 ng/㎖ 래트 rMASP-2 (또는 rMASP-2A)를 실온에서 밤샘 첨가하여 피복시켰다. 피복을
위한 저농도의 MASP-2은 고-친화도 항체의 선택을 가능하게 한다. 플레이트 튀김으로 피복 용액을 제거한 뒤,
200 ㎕의 BLOTTO (무지방 건조유)의 PBS 용액을 1시간 동안 각 웰에 첨가하여 비-특이적 부위를 차단하였다.
1 시간 뒤, 웰을 완충액 PBST (PBS, 0.05% Tween 20 함유)으로 세척하였다. 각 융합 웰에서 40 마이크로리터
의 배양 상청액을 수거하고 50 ㎕의 BLOTTO를 혼합하고, 그 다음 마이크로테스트 플레이트의 각 웰에 첨가하
였다. 1 시간의 배양 후, 웰을 PBST로 세척하였다. 결합된 뮤린 항체를 홍당무 과산화효소 (HRP) 접합 염소
항-마우스 IgG (Fc 특이적)과의 반응에 의하여 검출하였으며 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West
Grove, Pa.), 1:2,000으로 BLOTTO 내에서 희석하였다. 발색을 위하여 0.1% 3,3,5,5 테트라메틸 벤지딘
(Sigma, St. Louis, Mo.) 및 0.0003% 과산화수소 (Sigma)을 함유한 과산화효소 기질 용액을 30분 동안 각 웰
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