Untersuchungen zur Analytik und zum Einfluss technologischer ...

Arbeitsvorschriften 119
Caseinproben
20 g Caseinlösung (2,6 %, 0,53 g Casein / 20 ml Wasser) wurden mit 20 mg
Cloxacillin, Ampicillin bzw. Penicillin G 2 h mittels Schüttelmaschine bei 100 min -1
geschüttelt und 3 Tage bei 4 – 6 °C gelagert
Dialyse
20 ml Casein- bzw. Milch-Probe wurden als Doppelbestimmung im Dialyseschlauch
gegen 5.000 ml PBS-Puffer bei 4 – 6 °C über 5 Tage bei drei Pufferwechseln
(Akzeptorlösung) täglich dialysiert.
Für die Donorlösung wurde mittels Penzym Test (Chr. Hansen, Nienburg) die
Abwesenheit von intaktem β-Lactam bestätigt.
Die Donorlösung wurde über eine zweite Methode auf intaktes Penicillin untersucht.
Hierbei wird zur Penicillinlösung zunächst Caroxypeptidase und im zweiten Schritt, zur
Fluoreszenzmarkierung Bocillin gegeben. Intaktes Penicillin regiert nun mit der
Carboxypeptidase, die im zweiten Schritt zur Reaktion mit Bocillin nicht mehr zur
Verfügung steht. Das Signal wird kleiner je höher die Konzentration an Penicillin in der
Probe. Nach HPLC-Trennung zeigte eine identische Fläche von Puffer-Vergleich und
Probe für das fluoreszenzmarkierte Molekül das nicht vorhanden sein von intaktem
Penicillin an [Keppler und Cacciatore, 2002].
Durchführung:
• HPLC Anlage LaCrom, Merck-Hitachi mit Fluoreszenzdetektor (VWR
International, Darmstadt) und Gelfiltrationssäule Zorbax GF-250 (250 mm,
4 µm, 150 Å, Agilent, Waldbronn)
• Eluent: 15 % Acetonitril, 75 % 200 mmol Phosphatpuffer pH 6,6
• Probenaufarbeitung: 20 µl Milch + 20 µl Carboxypeptidase, 1:5
verdünnt, 10 Min bei 42 °C, + 20 µl Bocillin (100ng/ml) zur
Fluoreszenzmarkierung, 5 Min bei 42 °C, + 60 µl PBS-Puffer
• Injektion: 50 µl