Identifikation und immunologische Charakterisierung von MHC ...

3. Methoden
zunächst in der Zellkulturflasche mit PBS gewaschen und anschließend mit
Trypsin/0,5 mM EDTA bedeckt. Der Ablöseprozess konnte mikroskopisch
verfolgt werden. Die abgelösten Zellen wurden in Komplettmedium (zur
Inaktivierung des Trypsins) aufgenommen und entsprechend verdünnt
wieder ausgesät werden.
3.1.1.3 Kryokonservierung und Rekultivierung von Zellen
Zur Kryokonservierung wurden die Zellen zentrifugiert (380 g, 5 min) und
anschließend in eiskaltem, sterilfiltriertem Einfriermedium (50 % FCS, 40 %
RPMI-1640, 10 % DMSO) so resuspendiert, dass eine Zelldichte von 4*10 6 bis
1*10 7 Zellen/ml resultierte. Die Zellen wurden in Kryoröhrchen überführt und
in einer Einfrierbox bei –70°C eingefroren. Nach einem Tag wurden die
Röhrchen in flüssigen Stickstoff überführt.
Die Rekultivierung der Zellen erfolgte durch rasches Auftauen in einem 37°C-
Wasserbad. Die aufgetaute Zellsuspension wurde sodann in ein 15 ml Falcon-
Röhrchen mit PBS überführt, die Zellen zentrifugiert und der DMSO-haltige
Überstand abgesaugt. Die Zellen wurden anschließend in vorgewärmten
Komplettmedium aufgenommen und in einen Zellinkubator überführt.
3.1.2 Isolierung und Kultivierung humaner Blutzellpopulationen
3.1.2.1 Isolierung mononukleärer Blutzellen (PBMC) mittels
Dichtegradientenzentrifugation
Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes können aufgrund ihrer Dichte von
den anderen Bestandteilen des Blutes getrennt werden. Heparinisiertes Blut
wurde 1:1 mit PBS verdünnt und über Ficoll-Hypaque in Zentrifugenröhrchen
geschichtet. Nach Zentrifugation (bei 450 x g für 35 Minuten ohne Bremse)
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