Identifikation und immunologische Charakterisierung von MHC ...
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3. Methoden<br />
3.1.8.1 Vermehrung rekombinanter Adenoviren<br />
Für die Transfektion wurden HEK 293a-Zellen in 20 x 6 cm Schalen (5 ml<br />
DMEM/Schale, ungefähr 60 % Konfluenz) ausgelegt. Anschließend wurden<br />
pro Schale 500 µl HEBS <strong>und</strong> 5 µl HeringSperm-DNA-Lösung (0,2% (w/v)<br />
HeringSperm DNA, 15 mM NaCl, 1,5 mM Na-Citrat, pH=7,0, als Träger-DNA)<br />
in ein 15 ml Röhrchen gegeben <strong>und</strong> dieses mittels eines Vortexers für 1 min<br />
gründlich gemischt. Anschließend wurde dem Gemisch die zu transfizierende<br />
Virusvorkultur, die das Gen für PR3/LAMP-1 bzw. GFP enthält, (5 µg) <strong>und</strong><br />
tropfenweise 25 µl 2,5 M Kalziumchlorid-Lösung zugegeben. Nach 30 min<br />
Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Transfektionsansätze auf je eine 6<br />
cm Schale getropft <strong>und</strong> diese 8-16 h im Brutschrank inkubiert. Im Anschluss<br />
an die Inkubation wurde das Medium abgesaugt <strong>und</strong> frisches Kulturmedium<br />
zugegeben. Nach Eintreten des zytopathischen Effektes (3-4 Tage) r<strong>und</strong>en <strong>und</strong><br />
lösen sich die Zellen ab. Die abgelösten Zellen <strong>und</strong> der Überstand wurden in<br />
ein 15 ml Reaktionsgefäß überführt <strong>und</strong> zentrifugiert (5 min, 1500 g,<br />
Raumtemperatur). Der Überstand wurde verworfen <strong>und</strong> das Pellet in 500 µl<br />
PBS aufgenommen. Anschließend wurden die Zellen durch dreimaliges<br />
einfrieren (mit Trockeneis) <strong>und</strong> wiederauftauen (37° C Wasserbad) lysiert,<br />
damit die Viruspartikel freigesetzt werden. Nun wurden in zehn 15 cm<br />
Kulturschalen HEK293a-Zellen ausgesät <strong>und</strong> bis zur Konfluenz im<br />
Brutschrank inkubiert. Das Medium wurde abgesaugt <strong>und</strong> die Zellen mit 2 ml<br />
des vorher gewonnenen Überstandes, der Viruspartikel enthält, tranzduziert.<br />
Die Schalen wurden 30 min im Brutschrank inkubiert, wobei die Schalen nach<br />
15 min geschwenkt wurden, um ein Austrocknen der Zellen zu vermeiden.<br />
Anschließend wurden die Schalen mit frischem Medium aufgefüllt. Nach<br />
Eintreten des zytopathischen Effektes wurde das Medium <strong>und</strong> die Zellen in<br />
ein 15 ml Reaktionsgefäß überführt <strong>und</strong> der Virus wie oben beschrieben<br />
isoliert. Bis zur Aufreinigung wurde die Viruslösung bei –80° C eingefroren.<br />
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