Identifikation und immunologische Charakterisierung von MHC ...

3. Methoden
Anschließend wurde die DNA mit der zweiten Restriktionsendonuklease
geschnitten.
Die Restriktionen wurden für 2 bis 4 Stunden bei der für das
Restriktionsenzym optimalen Reaktionstemperatur (meist 37 °C) inkubiert.
Daraufhin erfolgte eine Überprüfung der Restriktion im Agarosegel und eine
anschließende Reinigung der geschnittenen DNA vor der weiteren
Verwendung.
3.2.2.5 Dephosphorylierung der Plasmide vor einer Ligation
Um bei der Ligation die Wahrscheinlichkeit einer Religation der Plasmide zu
verringern, wurden die Plasmide nach der Restriktion dephosphoryliert. Dazu
wurden die Restriktionsansätze 30 Minuten bei 37°C mit alkalischer Shrimp-
Phosphatase (SAP) inkubiert. Dabei wurden für 5'-überhängende Enden 0,1
Unit bei 1 pmol Termini benötigt. Dies entspricht ca. 2,5 µg eines 3 kb großen
Plasmids. Um SAP zu inaktivieren, wurde der Ansatz für 15 Minuten bei 65 °C
inkubiert.
3.2.2.6 Ligation von DNA-Fragmenten
Ziel der Ligation ist es, glatte oder überhängende Enden von DNA-
Fragmenten mit Hilfe der T4-DNA-Ligase kovalent über die endständige 5´-
Phosphatgruppe mit der freien 3´-OH Gruppe zu verknüpfen.
Vektoren und zu inserierende DNA-Fragmente wurden im molaren Verhältnis
von 1:3 mit einer Gesamtmenge an DNA von maximal 200 ng eingesetzt. Die
DNA wurde in 17 µl ddH2O aufgenommen und mit 2 µl 10x T4-DNA-
Ligationspuffer versetzt. Der Reaktionsansatz wurde vermischt und nach
Zugabe von 1 µl T4-DNA-Ligase 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
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