Identifikation und immunologische Charakterisierung von MHC ...

3. Methoden
3.1.3.3 Einzelzellklonierung
Peptidspezifische T-Zelllinien wurden durch limitierende Verdünnung (je
nach Wachstumsverhalten der T-Linien 0,3-3 Zellen/Loch) in Anwesenheit
von 1x10 5 radioaktiv bestrahlten (90 Gy), allogenen PBMC als
Stimulatorzellen, 5 µg/ml Phytohämaglutinin (PHA) und 10 IU/ml rhIL-2
kloniert. Alle 3-4 Tage wurde das Medium gegen frisches, 10 IU/ml rhIL-2
enthaltendes, RPMI 1640 ausgetauscht. Nach durchschnittlich 12-14 Tagen
wurden die proliferativen Zellen sichtbar und erneut in Proliferationstests auf
ihre Peptid-Spezifität hin getestet.
3.1.3.4 Expansion und Analyse der T-Zellklone
Die peptid-spezifischen T-Zellklone wurden wöchentlich mit autologen,
radioaktiv-bestrahlten (30 Gy) PBMC in Anwesenheit des spezifischen Peptids
(20 mg/ml) in 10 IU/ml rhIL-2 enthaltendes, RPMI 1640 restimuliert. Alle 3-4
Tage wurde frisches RPMI 1640 mit 10 IU/ml rhIL-2 zugefügt.
Zur Analyse wurden die T-Zellklone (3x10 4 Zellen/Loch) in eine 96-Lochplatte
überführt. Die T-Zellen wurden in Anwesenheit verschiedener
Konzentrationen des Antigens (Peptid, rekombinantes Protein bzw.
Tumorzelllysate) mit radioaktiv-bestrahlten (30 Gy), autologen dendritischen
Zellen (DC) in RPMI 1640-Medium kokultiviert. In einigen Fällen wurden
zusätzlich verschiedene Antikörper gegen die MHC I- bzw. MHC-II-Moleküle
(20 µg/ml) hinzugegeben. Antigen-spezifische T-Zellantworten wurden
wiederum in Proliferationstests gemessen.
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