Identifikation und immunologische Charakterisierung von MHC ...

3. Methoden
3.1.7 Herstellung von Zelllysaten für die Beladung von DC
Von verschiedenen Zelllinien wurden 5x10 6 Zellen geerntet und in 2ml RPMI
1640 in ein 1,5 ml Eppendorf-Reagiergefäß überführt. Die Zellsuspension
wurde fünfmal in flüssigem Stickstoff schockgefroren und im 37°C warmen
Wasserbad wieder aufgetaut. Anschließend wurde die Zellsuspension 10 sec
im Ultraschallbad behandelt. Vor der weiteren Verwendung der Zelllysate
wurden diese bei - 80°C gelagert.
3.1.8 Vermehrung und Aufreinigung rekombinanter Adenoviren
Das Adeno-X TM System wurde von der Fa. Clontech (Heidelberg,
Deutschland) bezogen. Dieses System besteht aus einem „shuttle“ Plasmid
(pShuttle, siehe Anhang) und einem adenoviralen „backbone“ Plasmid
(pAdeno-x, siehe Anhang). Das Plasmid pShuttle enthält eine MCS zwischen
einem humanen CMV Promotor und dem BGH-Polyadenylierungssignal.
Zudem enthält es eine Kanamycin-Resistenz zur Selektion transformierter
E. coli. 5’ des Promotors befinden sich eine I-CeuI Schnittstelle, 3´ des BGH-
polyA befindet sich eine PISceI Schnittstelle. Diese beiden Schnittstellen dienen
der Einklonierung der Transgenkassette in die entsprechende Stelle des
adenoviralen Genoms.
Das Plasmid pAdeno-X besitzt zwischen den beiden Schnittstellen I-CeuI und
PI-SceI eine SwaI Schnittstelle. Zudem enthält es eine Ampicillin-Resistenz zur
Selektion transformierter E. coli. Im Anschluss an die Ligation von pAdeno-X
und Transgen-Kassette wurden die Ligationsansätze mit SwaI geschnitten. Das
fertige Konstrukt wurde mit PacI geschnitten und in HEK293a Zellen
transfiziert (=Virusvorkultur).
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