Identifikation und immunologische Charakterisierung von MHC ...

3. Methoden
5 µl PCR-Puffer (10x)
250 µM jedes dNTP
5 pmol jedes Primers
2,5 mM MgCl2
1 U Taq-Polymerase
ad 50 µl H2O
Für ein bis zu 1500 bp langes DNA-Fragment fand die Amplifikation in einem
DNA-Thermo-Cycler nach folgendem Programm statt (x: je nach Primer
zwischen 52 und 60 °C):
1. 5 Minuten 94 °C (einmalige Denaturierung)
2. 1 Minute 94 °C
1 Minute x °C 35 Zyklen
1,5 Minuten 72 °C
3. 10 Minuten 72 °C (abschließende Polymerisationsreaktion)
Im Anschluss an die PCR wurden die amplifizierten Produkte im Agarosegel
analysiert.
3.2.2.2 Agarose-Gelelektrophorese
Plasmide und DNA-Fragmente wurden auf 0,8-1,2 % Agarose-Gelen (0,1
mg/ml Ethidiumbromid) der Abmessung 80x90x7 mm bei 100 V aufgetrennt.
Als Elektrophoresepuffer wurde TAE-Puffer verwendet. Vor dem Auftrag der
DNA-Proben auf das Gel wurden die Proben mit DNA-Probenpuffer versetzt.
Parallel zu den Proben wurde ein DNA-Größenstandard aufgetrennt. Die
Detektion der DNA erfolgte unter UV-Licht (254 nm).
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