Identifikation und immunologische Charakterisierung von MHC ...

3. Methoden
3.3.4 Transfer von Proteinen auf Nitrozellulosemembranen
Nach der Gelelektrophorese wurden die Proteine für 2 Stunden bei 60 V oder
für 1 Stunde bei 100 V in einer Naßblotapparatur aus dem Gel auf eine
Nitrozellulosemembran transferiert. Dazu wurden drei Lagen Whatman-
Papier in Tris-Glycin Puffer getränkt und das Gel vorsichtig daraufgelegt. Die
angefeuchtete Nitrozellulosemembran wurde blasenfrei auf das Gel gelegt,
darauf kamen wiederum drei Lagen Whatman-Papier. Die Proteine wurden in
Richtung Anode auf die Nitrozellulosemembran transferiert.
3.3.3 Färbung von Proteinen in Nitrozellulosemembranen mit Ponceau-Rot
Zur Prüfung der Proteinbeladung und der Kontrolle des Western Blots wurde
eine Proteinfärbung auf der Nitrozellulose-Membran mittels Ponceau-Rot
durchgeführt. Hierzu wurde die Membran für 2-3 min in Ponceau-Lösung (2%
(w/v) Ponceau S, 3% (v/v) Essigsäure) gelegt und danach die
Hintergrundfärbung durch ddH2O entfernt. Eine vollständige Entfärbung
erfolgte durch Inkubation mit TBS-T.
3.3.5 Immundetektion (Western Blot Analyse)
Durch Immundetektion wurden Proteine auf der Nitrozellulosemembran mit
spezifischen Antikörpern sichtbar gemacht. Nach dem Transfer der Proteine
auf die Membran wurden zunächst unspezifische Bindungsstellen der
Antikörper auf der Membran mit Blockpuffer 1 Stunde bei RT oder über Nacht
bei 4 °C abgesättigt. Die anschließenden Inkubationen der Membran mit
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