Identifikation und immunologische Charakterisierung von MHC ...
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3. Methoden<br />
Antikörpern sowie alle Waschschritte wurden in Blockpuffer durchgeführt.<br />
Die Inkubation mit dem jeweiligen primären Antikörper erfolgte für 45<br />
Minuten bei RT. Nach 2maligem Waschen für 10 Minuten in Blockpuffer<br />
wurde die Membran mit dem Meerrettichperoxidase (HRP)-gekoppelten,<br />
Spezies-spezifischen sek<strong>und</strong>ären Antikörper für 30 Minuten bei RT inkubiert.<br />
Abschließend wurde die Membran dreimal für je 10 Minuten in Waschpuffer<br />
gewaschen.<br />
Die Detektion erfolgte mit dem ECL-Chemilumineszenzsystem, bei dem<br />
Luminol durch Wasserstoffperoxid oxidiert wird. Durch die Anregung des<br />
Luminolmoleküls wird Licht der Wellenlänge λ = 428 nm emittiert. Die<br />
Reaktion wird durch die Antikörper-geb<strong>und</strong>ene Peroxidase HRP in alkalischer<br />
Lösung katalysiert. Je 10 ml der ECL-Lösungen 1 <strong>und</strong> 2 wurden gemischt <strong>und</strong><br />
die Membran für 1 bis 2 Minuten darin inkubiert. Im Dunkeln wurden dann<br />
Röntgenfilme in verschiedenen Zeitintervallen belichtet <strong>und</strong> anschließend<br />
entwickelt.<br />
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