Identifikation und immunologische Charakterisierung von MHC ...

3. Methoden
3.2.1.3 Präparation von Plasmid-DNA in kleinem Maßstab (Mini-Präp)
3 ml LB-Medium mit Kanamycin oder Ampicillin wurden mit jeweils einer
Bakterienkolonie von der Agarplatte angeimpft und über Nacht bei 37 °C
unter schütteln inkubiert. 2 ml der Bakterienkulturen wurden zentrifugiert
(14.000 x g, 2 Minuten, RT), das Sediment in 200 µl S1 resuspendiert und nach
Zugabe von 200 µl S2 für 5 Minuten bei RT inkubiert. Anschließend wurden
200 µl S3 zugegeben und weitere 5-10 Minuten auf Eis inkubiert. Unlösliche
Bakterienbestandteile wurden nach der Zentrifugation (14.000 x g, 10 Minuten,
4°C) verworfen. Der Überstand wurde mit 600 µl Isopropanol gemischt. Nach
dem Zentrifugieren (14.000 x g, 10 Minuten, RT) der Plasmid-DNA wurde
diese mit 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und in 50 µl H2O aufgenommen.
Zur Stammkulturhaltung wurden die Bakteriensuspensionen mit 25 % (v/v)
Glyzerin versetzt und bei -80 °C eingefroren.
3.2.1.4 Präparation von Plasmid-DNA in quantitativem Maßstab
Für die Aufreinigung von Plasmid-DNA wurde der „QIAfilter Plasmid Maxi“-
Kit der Firma Qiagen verwendet. Um Plasmid-DNA in größeren Mengen zu
gewinnen, wurden 500 ml LB-Medium mit Kanamycin oder Ampicillin mit
der entsprechenden Bakterienkultur angeimpft und bei 37 °C unter schütteln
inkubiert. Die Bakterien wurden zentrifugiert (5000 x g, 10 Minuten, 4 °C), und
in 10 ml P1 Puffer resuspendiert. Durch Zugabe von 10 ml Puffer P2 und
Inkubation für 5 min wurden die Zellen lysiert. Die alkalische Lösung wurde
durch Zugabe von 10 ml Puffer P3 neutralisiert und auf eine Filterkartusche
überführt. Nach 10 min Inkubation wurde das Lysat filtriert und mit 2,5 ml
ER-Puffer vermischt. Nach 30 min Inkubation wurde das Filtrat über eine
QBT-Puffer äquilibierte Qiagen-tip 500 Säule gegeben und die Säule
anschließend 3x mit 30 ml QC-Puffer gewaschen. Die an die Säule gebundene
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