Identifikation und immunologische Charakterisierung von MHC ...

3. Methoden
3.1.4 Durchflußzytometrie (FACS)
Vor der durchflußzytometrischen Färbung wurden die Zellen zunächst in
FACS-Puffer (2 % FCS + 0,02 % NaN3 in PBS) gewaschen und anschließend bei
4° C für 30 min mit 5 µg/ml des jeweiligen direkt markierten Antikörpers in
FACS-Puffer inkubiert. Nach zwei finalen Waschschritten wurden die Zellen
auf einem FACSCalibur® Durchflußzytometer unter Verwendung der
CELLquest® Software (Beckton Dickinson, Heidelberg) analysiert. Die
Kalibrierung des Gerätes erfolgte über eine nichtgefärbte Probe
(Autofluoreszenz), die Bestimmung der unspezifischen Färbung der Zellen
über einen irrelevanten Antikörper gleichen Isotyps (Isotyp-Kontrolle). Um
den Anteil an toten Zellen in den Proben zu bestimmen, wurden die Ansätze
mit 1 µl Propidiumiodid (0,2 %) versetzt. Die Proben wurden direkt im
Anschluss an die Färbung gemessen.
3.1.5 Bestimmung der Zytokinproduktion mittels ELISA
Die Bestimmung der Zytokine in den Zellkulturüberständen von peptid-
stimulierten CD4+ T-Zellklonen erfolgte mittels ELISA („enzyme linked
immunosorbent assay”). Hierzu wurde einer 96-Loch-Maxisorpplatte 100 µl
Primärantikörper pro Vertiefung (2 mg/ml in Natriumphosphatpuffer, pH 9)
zugegeben und über Nacht bei 4°C inkubiert. Am nächsten Tag wurde die
Platte zweimal mit PBS gewaschen und anschließend 100 µl PBS 1% BSA in
jede Vertiefung für zwei Stunden bei 37°C gegeben. Daraufhin wurde zweimal
mit PBS gewaschen, und dann die Kulturüberstände und die, in einer 1:2
Verdünnung titrierten Standards und reines Medium als Leerwert auf die
Platte gegeben (100 µl / Vertiefung). Es folgte eine Inkubation von zwei
Stunden bei Raumtemperatur und danach vier Waschschritte. Daraufhin
wurden 100 µl des biotinylierten Sekundärantikörpers (1 µg/ml in PBS 0.1%
BSA) zugegeben und die Platte für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Nach sechs
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