Identifikation und immunologische Charakterisierung von MHC ...

3. Methoden
wurden die mononukleären Zellen aus der Interphase zwischen dem Ficoll
und dem Plasma mit einer Pasteurpipette abgezogen. Nach dreimaligem
Waschen mit PBS, bei 380 x g für jeweils 5 Minuten, wurden die Zellen
anschließend in komplettem AIM-V-Medium aufgenommen und ausgezählt
(siehe 3.1.1.1).
3.1.2.2 Isolierung von Monozyten und Differenzierung zu dendritischen
Zellen
Dendritische Zellen (DC) wurden aus der monozytären Blutzellfraktion
generiert. PBMC wurden wie unter 3.1.2.1 beschrieben über einen Ficoll-
Dichtegradienten isoliert und 5 x 10 7 Zellen in 75 cm 2 Zellkulturflaschen mit
10 ml DC-Medium für 2 Stunden bei 37°C inkubiert. In dieser Zeit adhärierten
die Monozyten an die Plastikoberfläche der Zellkulturflasche. Die nicht-
adhärenten Zellen (NAC) wurden entfernt und die verbleibende Zellfraktion
in DC-Medium, welches rhGM-CSF (1000 U/ml) und IL-4 (1000 U/ml)
enthielt, für sechs Tage kultiviert. An den Tagen drei und fünf wurden die
entsprechenden Zytokine erneut hinzugefügt. Nach sechs Tagen in Kultur
wurden die noch unreifen DC geerntet, gezählt und 2x10 6 Zellen in 1 ml DC-
Medium in eine 24-Lochplatte überführt. Für die Reifung der DC wurde ein
zweiter Zytokincocktail, bestehend aus TNFa (10 ng/ml), IL-1β (10 ng/ml),
IL-6 (10 ng/ml) und PGE2 (1 µg/ml), zugefügt. Nach 24 Stunden wurden die
reifen DC (mDC) geerntet und in anschließenden Experimenten verwendet.
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