Identifikation und immunologische Charakterisierung von MHC ...

3. Methoden
3.2.2.3 Elution von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen
Die durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennten DNA-Fragmente wurden
unter UV-Licht aus dem Agarosegel als kleiner Block ausgeschnitten; ein
Arbeitsschritt, der sehr rasch erfolgen musste, um Strangbrüche und
Mutationen der DNA durch das UV-Licht zu verhindern. Die in der wäßrigen
Phase des Gels enthaltene DNA wurde durch Zentrifugation über ein
Glaswolle-Filter für 5 Minuten bei 14000 x g von der festen Agarosematrix
getrennt. Zu dem Durchfluss wurde das 2,5-fache Volumen EtOH und 1 /10
Volumen KAc gegeben. Die DNA wurde für 1 Stunde auf Trockeneis oder bei
-20 °C über Nacht gefällt und dann für 1 /2 Stunde bei 14000 x g (4° C)
pelletiert. Abschließend wurde die DNA mit 70 % EtOH gewaschen und nach
dem Trocknen in 50 µl ddH2O resuspendiert.
3.2.2.4 Spaltung von Plasmid-DNA durch Restriktions-Endonukleasen
Restriktionsendonukleasen sind in der Lage, doppelsträngige DNA an für sie
spezifische, meist palindrome Erkennungssequenzen zu schneiden. Für eine
vollständige Restriktion benötigen die Restriktionsenzyme spezielle Puffer, die
optimale Ionenstärke und den adäquaten pH-Wert liefern. Die für eine
Restriktion benötigte Menge Enzym richtet sich nach der zu schneidenden
DNA-Menge. Zur groben Abschätzung kann man davon ausgehen, dass 1 U
Restriktionsenzym ausreicht, um 1 µg DNA in einem 50 µl Ansatz innerhalb
einer Stunde zu schneiden.
Sequenzielle Doppelrestriktionen wurden in zwei Schritten durchgeführt,
jeder in Bezug auf die jeweilige Restriktionsendonuklease optimiert. Nach der
ersten Restriktion wurde der Ansatz in einem Agarosegel aufgetrennt, die
entsprechende DNA-Bande aus dem Gel eluiert und aufgereinigt.
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