Identifikation und immunologische Charakterisierung von MHC ...

4. Ergebnisse
lysosomal-verwandtes Organell (LRO), welches ebenfalls hohe Mengen an
LAMP-1 enthält. Da dort die Antigenbeladung der MHC-Klasse-II-Moleküle
stattfindet, sollte das Fusionsprotein über die zytoplasmatischen
Sortierungssignale vermehrt auch in die MHC-II-Kompartimente entlang der
biosynthetischen Route transportiert werden (Ruff et al., 1997). Die Transduktion
des Virus in DC und die anschließende Expression des chimären Proteins diente
als alternative Stimulationsmöglichkeit neben der Beladung der MHC-II-
Kompartimente über exogene Zufuhr und anschließender Endozytose.
Die Details der Klonierung sind unter Material und Methoden ausführlich
dargelegt und die Plasmidkarten sind im Anhang zusammengestellt. Die
wesentlichen Klonierungsschritte waren:
1) Ligation und Klonierung des PR3- und LAMP-1-Gens in das Plasmid
pcDNA3.1
2) Ligation und Klonierung des PR3-LAMP-1-Konstrukts, bzw. für die Kontrolle
das GFP-Gen, in das Plasmid pShuttle. Dieses Plasmid enthält den humanen
CMV-Promoter und einen SV40 polyA.
3) Herstellung der adenoviralen Plasmide: Die Gene wurden aus pShuttle
herausgeschnitten und in das Plasmid pAd5/F35 hineinkloniert.
4) Transfektion der adenoviralen Plasmide in HEK293a-Zellen: pAd5/F35-
PR3/LAMP-1 bzw. –GFP wurden nach Linearisierung in HEK293a-Zellen
transfiziert, einzelne Virus-Plaques wurden isoliert und weiter analysiert.
Abb. 4.5 zeigt die entscheidenden Schritte: (a) Kontrolle der Klonierung des
chimären Gens (PR3-LAMP-1) in pcDNA3.1, (b) Kontrolle der Klonierung des
chimären Gens in pShuttle und (c) die Restriktionsanalyse der Vektor-DNA -
beispielhaft für Ad5/F35-PR3/LAMP-1. Die Analysen zeigen die in HEK293a-
Zellen transfizierte virale DNA.
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