Identifikation und immunologische Charakterisierung von MHC ...

3. Methoden
Plasmid-DNA wurde dann mit 20 ml Puffer QN eluiert und durch eine
Fällung mit Isopropanol gewonnen. Die präzipitierte DNA wurde in
endotoxin-freiem Wasser aufgenommen und die Konzentration bestimmt.
3.2.2 DNA-analytische Methoden
3.2.2.1 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)
Die PCR ermöglichte die in vitro Amplifikation definierter DNA-Fragmente
und wurde in dieser Arbeit zur Einführung von Schnittstellen in DNA-
Fragmente und zur Vervielfältigung von zu klonierenden DNA-Fragmenten
eingesetzt. Die eingeführten Schnittstellen erlaubten nach einer Restriktion die
gerichtete Klonierung der PCR-Produkte in ein Plasmid. Um eine spezifische
Sequenz für einen weiteren Klonierungsschritt mit bestimmten
Restriktionsschnittstellen zu amplifizieren, wurde ein Standard PCR-Protokoll
durchgeführt In Abhängigkeit von den verwendeten Primern variierte die
Annealingtemperatur zwischen 52 °C und maximal 60 °C.
Die Kettenreaktion lässt sich in drei Schritte unterteilen: Im ersten Schritt wird
die zu amplifizierende dsDNA thermisch (94 bis 100 °C) denaturiert, so dass
zwei Einzelstränge vorliegen. Im nächsten Schritt erfolgt bei einer geringeren
Temperatur (45 bis 72 °C) die Hybridisierung („annealing“) der Primer an die
ssDNA. Die Primer werden im dritten Schritt, der bei einer Temperatur von
72 °C abläuft, durch eine thermostabile DNA-Polymerase (Taq-Polymerase)
verlängert. Diese drei Schritte werden zyklisch wiederholt, und durch eine 25-
bis 35-fache Wiederholung dieses Zyklus lässt sich eine Amplifikation der
DNA um den Faktor 10 9 erreichen.
PCR-Reaktionen wurden in einem Volumen von 50 µl durchgeführt. Die
Ausgangsmenge an Template-DNA betrug 500 ng. Ein PCR-Ansatz enthielt
neben der zu amplifizierenden DNA:
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