Identifikation und immunologische Charakterisierung von MHC ...

3. Methoden
3.2 Molekularbiologische Methoden
3.2.1 Arbeiten mit Bakterien
3.2.1.1 Herstellung chemisch kompetenter Bakterien nach der Mehrionen-
Technik
100 ml LB-Medium mit 10 mM MgCl2 und 10 mM MgSO4 wurden mit 0,5 ml
einer Bakterienkultur angeimpft und bei 37 °C unter schütteln inkubiert, bis
eine optische Dichte von etwa 0,5 bei 595 nm Wellenlänge erreicht war. Die
Bakterien wurden dann in 50 ml Falcon-Röhrchen überführt und auf Eis
2 Minuten abgekühlt. Nach dem Zentrifugieren (5000 x g, 10 Minuten, 4 °C)
wurde das Bakteriensediment in 30 ml eiskaltem TfB1 resuspendiert, 30-
60 Minuten auf Eis inkubiert, wieder abzentrifugiert, in 5 ml TfB2
aufgenommen und weitere 15 Minuten auf Eis belassen. Die kompetenten
Bakterien wurden anschließend portionsweise in flüssigem Stickstoff
schockgefroren und bei –80 °C gelagert.
3.2.1.2 Transformation chemisch kompetenter Bakterien
Kompetente Bakterien wurden auf Eis aufgetaut und jeweils 50 µl mit 100-
500 ng Plasmid-DNA für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Danach erfolgte eine
Inkubation bei 37 °C für 5 Minuten und auf Eis für weitere 2 Minuten. Nach
Zugabe von 0,5 ml LB-Medium mit 10 mM MgCl2 und 10 mM MgSO4 wurde
die Bakteriensuspension für 1 Stunde bei 37 °C geschüttelt und anschließend
auf Agarplatten mit dem entsprechenden für die Selektion verwendeten
Antibiotikum (Ampicillin, Kanamycin) ausplattiert.
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