Identifikation und immunologische Charakterisierung von MHC ...

3. Methoden
3.1.8.4 Adenovirus Titration (Plaque-Test)
Die Titration der Adenovektoren wurde nach Hitt et al. (1995) durchgeführt.
Am Vortag der Titration wurden pro Titration 12-16 Schalen HEK293a Zellen
zugegeben. Für die Erstellung einer Verdünnungsreihe wurde für den ersten
Verdünnungsschritt 90 µl PBS mit 10 µl des zu titrierenden Ad5/F35 gemischt.
Die nachfolgenden Verdünnungsschritte erfolgten mit je 540 µl PBS und 60 µl
Ad5/F35-Lösung der vorangegangenen Verdünnung. Es wurden stets zwei
unabhängige Verdünnungsreihen erstellt und die Transduktionen jeder
Verdünnungsreihe erfolgten in Doppelansätzen. Die Transduktionen wurden
mit je 200 µl der entsprechenden Verdünnung (in der Regel 10 -5 - 10 -10 pfu)
30 min im Brutschrank durchgeführt Nach der Transduktion wurde den
Zellen frisches DMEM plus aufgekochter und 30 min bei 42°C abgekühlter 1%
(w/v) Zellkultur-Agarose (Verhältnis 1:1; 10 ml/ Schale) zugegeben. Diese
wurden bei Raumtemperatur inkubiert bis das Gemisch erstarrt war.
Anschließend wurden die Zellen im Brutschrank inkubiert und die Plaques
(durch Zelllyse entstandene Löcher im Zellrasen) nach sieben bis zehn Tagen
ausgezählt und der Titer berechnet (Bestimmung des biologischen Titers: Titer
[pfu/ml] = Mittelwert der Plaques pro Schale/ [Verdünnungsfaktor x
Volumen des zugefügten verdünnten Virus zu den Zellen]).
3.1.8.5 Transduktion von Zielzellen
Zielzellen (DC oder 293a) wurden mit unterschiedlicher MOI transduziert.
Hierfür wurden die Zellen in einer 24-Loch-Platte ausgesät (1x10 6 Zellen/Loch
in DMEM) und 24 Stunden inkubiert (37°C, 5 % CO2). Nach Dekantieren des
Überstandes wurden die Zellen mit unterschiedlicher MOI in einem Volumen
von 300 µl transduziert. Nach zwei Stunden Inkubation wurde den Zellen
700 µl frisches Medium hinzugegeben. 24 bzw. 48 Stunden später konnten die
transduzierten Zellen für weitere Versuche verwendet werden.
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