Identifikation und immunologische Charakterisierung von MHC ...

3. Methoden
Die Bestimmung der Reinheit der Proben erfolgte durch
spektrophotometrische Messung und Bildung des OD 260 /OD 280 Verhältnisses
(Ziel: zwischen 1,8 und 2,0). Zur Bestimmung der Konzentration wurde die
OD 260 gemessen. Die RNA wurde bei –80 °C gelagert.
3.2.3.2 RT-PCR
Die RT-PCR (Reverse Transkription/PCR) ermöglicht es, den kodierenden
Bereich eines Gens ausgehend von der dazugehörigen mRNA in cDNA zu
übersetzen und zu amplifizieren. Hierzu isoliert man zuerst die mRNA aus
Zellen und übersetzt anschließend die Poly(A)-mRNA mit Hilfe der Reversen-
Transkription in einzelsträngige DNA (ssDNA). Im zweiten Schritt wird diese
mit Hilfe zweier spezifischer Primer amplifiziert. Bei der Reversen-
Transkription wurden eingesetzt:
1-2 µg Gesamt-RNA
2,5 µM Oligo dT16 (16-mer bestehend aus Thymidin)
1 mM dNTPs
1U RNase-Inhibitor
5 mM MgCl2
2 µl 10fach PCR-Puffer
add 20 µl dH2O
Der Ansatz wurde für 5 min auf 65°C erhitzt, um vorhandene
Sekundärstrukturen der RNA zu zerstören. Zum Ansatz wurden 1,5 µl (1U)
MuLV-Reverse Transkriptase (Muriner Leukemia Virus-Reverse
Transkriptase) hinzugegeben, für 45 min bei 42°C inkubiert und anschließend
für 5 min auf 90°C erhitzt, um die Reverse Transkriptase zu inaktivieren. Der
so erhaltene Ansatz konnte zur Amplifikation der ssDNA direkt in einer PCR
verwendet werden.
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