teknik pembibitan tanaman dan produksi benih jilid 1 smk

cara menggerus jaringan tanaman
yang akan diuji kemudian diencerkan
dengan antigen buffer dengan
pengenceran 1/9. Masukan antigen
tersebu sebanyak 100 µl pada setiap
lubang plate ELISA.
Tutup plate ELISA dengan plastik
tipis dan diinkubasikan selama 1 jam
pada suhu tumbuh 37 o C atau
semalaman pada suhu kamar.
Primary (specific antiserum) harus
disiapkan terlebih dahulu. Selama
inkubasi (atau sebelum uji dimulai)
dapat dilakukan cross–adsorbtion
antiserum dengan jaringan sehat
dengan cara sebagai berikut.
Jaringan sehat dihancurkan dalam
serum buffer dengan pengeceran
1/20. Suspensi disaring dengan
menggunakan kain kasa. Encerkan
anti-serum sesuai anjuran dalam
suspensi tersebut. Aduk sampai rata
dan inkubasi selama 45 menit pada
suhu 37 o C.
Pencucian dilakukan dengan
langkah-langkah sebagai berikut.
Kosongkan plate ELISA. Cuci plate
ELISA dengan PBS Tween, rendam
selama 3 menit dengan PBS Tween,
ulangi sampai 4 kali cucian. Keringkan
dengan kertas tissue. Masukan
primary antiserum 100 µl setiap
lubang plate ELISA. Inkubasikan plate
tersebut selama 1 jam pada suhu
37 o C.
Secondary antiserum (conjugate)
harus disiapkan setelah primery
antiserum yaitu dengan cara:
Kosongkan plate ELISA dan cuci
dengan cara seperti di atas. Masukan
konjugasi antibody– Alkaline
phosphatase (tersedia secara
komersial sebagai SWAREC = Swine
antirabbit enzyme conju-gate) pada
pengenceran 1/1000–1/2000 dalam
serum buffer. Inkubasikan selama 1
jam pada suhu 37 o C.
Substrat dibuat setelah antiserum
siap untuk digunakan. Metoda
pembuatan substrat adalah sebagai
berikut: Kosongkan plate ELISA dan
cuci sebagaimana di atas. Buat
larutan substrat dari 1 tablet p–
nitrophenyl (PNPP), (tersedia se-cara
komersial) dalam 10–15 ml
diethanolamine buffer (DIEAB).
Masukan substrat tersebut 100 µl per
lubang. Inkubasikan selama 30 menit
pada suhu kamar. Reaksi positif yaitu
apabila terjadi perubahan warna
menjadi kuning.
Baca nilai absorban ultra violet
dengan menggunakan alat spektrofotometer.
Untuk menghentikan reaksi
dapat dilakukan dengan menambah
setetes 3 N NaOH pada tiap lubang.
Cara Pembuatan Buffer untuk Inderect
ELISA :
PBS (Phosphate Buffered Saline) :
6) 0,05 M KH2 PO4 /
Na2 HPO4 + 8,5 g Na Cl /l
7) pH 7,2
Antigen buffer:
a. PBS + 0,01
M NaDIECA.
PBS Tween (untuk mencuci)
• 1 liter PBS Tween
• 0,2 g KCl.
• 0,5 ml Tween 20
Serum buffer :
• 1 liter PBS Tween
• 20 g Polyvinylpyrrolidone (2 %)
(MW = 25.000)
• 2 g Ovalbumin (0,2 %)
136