Vypracované otázky z mikrobiologie

CabiCz & Lenjulenka 2010/2011
23. VYŠETŘOVÁNÍ CITLIVOSTI NA ANTIMIKROBIÁLNÍ LÁTKY
- kvalitativně diskovou difusní metodou nebo kvantitativně stanovením MIC resp. MBC diluční metodou
resp. vyočkováním, nebo tzv. E-testem
A. Disková difusní metoda
- založena na inhibici růstu zkoumaného bakteriálního kmene ATB difundujícím v konc. gradientu agarovou
půdou z testovacího disku (napuštěné kolečko z filtračního papíru)
- používá se MH agar (Mueller-Hintonův agar), pro růstově náročné - přídavek krve; výška vrstvy 3-4 mm,
pH 7,2-7,4
- suspenze (o zákalu podle McFarlanda 0,5) se plošně naočkuje přelitím (1 min nechat a přebytečné slít)
- aplikujeme disky s ATB (G-/G+), inkubace 16 - 24 hodiny → kolem disků inhibiční zóna s poloměrem
úměrným minimální inhibiční konc. daného ATB
- kvalitativní vyhodnocení dle tabulek s min. inhibič. průměrem
- výsledkem testu: kmen na dané ATB - citlivý/resistentní
B. Stanovení MIC a MBC
- v indikovaných případech:
o kvalitativní zjištění nedostatečné - sepse a jiné závažné stavy
o při neúspěchu léčby založeném na kvalitativním vyšetření apod.
- obvykle dilučním testem = naočkování zkoumaného kmene do média s různými konc. testovaných ATB
v řadě jamek miktrotitrační destičky
- po inkubaci pozorujeme zákal, první jamka v řadě stoupajících konc. s čirým médiem (růst byl potlačen)
→ konc. v dané jamce udává MIC
- koncentrace ATB udávána v mg/l a to např.: 0,1 - 0,2 - 0,5 - 1 - 2 - 4 - 8 - 16
- příprava a provedení je poměrně pracné, alternativou je tzv. E-test = komerčně dodávané proužky
filtračního papíru napuštěné koncentračním gradientem testovaného ATB (natištěná stupnice) →
položíme na plošně inokulovaný povrch agaru, inkubace, odečítáme inhibiční zóny - tvar kapky, nejširší na
konci proužku s nejvyšší konc. a zužují se do místa, kde již k inhib. nedochází → odečteme ze stupnice MIC
- stanovení MBC - vyočkováním média s různými konc. ATB z dilučního stanovení MIC na krevní nebo živný
agar → z čirých jamek (růst jen inhibován) vyrostou kolonie stejně jako z jamek zakalených (k inhibici ještě
nedošlo); MBC odpovídá koncentraci, která bakterie zahubí → na agaru nevyrostou
C. Detekce β-laktamas
- β-laktamasy (penicilinasy) → otevírají β-laktamový kruh ATB → konvertují tak např. penicilin na
neúčinnou kys. penicilinovou
- β-laktamasy dělíme na volné (produkované G+ koky do okolí) a vázané v periplasmovém prostoru buněč.
stěny hlavně G- bakterií (nejdříve nutné uvolnit lýzou z bakterií)
- někdy možný přenos produkce β-laktamas plasmidem na kmen, který je dříve neprodukoval → resistence
→ vyvinuta kombinovaná penicilinová ATB obsahující inhibitory β-laktamas - např. klavulanová kys.
- průkaz penicilinasy - jodometrickým testem: založen na redukčních vlastnostech kys. penicilinové
(narozdíl od penicilinu redukuje jod na jodid) → zkoumaný kmen inkubujeme v roztoku penicilinu →
pokud β-laktamasa, tak převedení na kys. penicilinovou → důkaz redukcí jodu na jodid - odbarvení
fialového komplexu jodu se škrobovým mazem (lze provést na indikačním papírku napuštěném
penicilinem, jodem a škrobem)
- existuje komerční beta-LACTAMtest → rychlé stanovení β-laktamasové aktivity stafylokoků, neisserií a
hemofilů (indikace okyselení kultivačního média hydrolýzou přidaného benzylpenicilinu)
39