Vypracované otázky z mikrobiologie

CabiCz & Lenjulenka 2010/2011
o Shickův test - intradermálně aplikujeme malou dávku difterického toxinu (Corynebacterium
diphteriae) - kontrola alergické reakce i toxoidu; negativní výsledek - protilátky zabrání zánětlivé
reakci - znamená dostatečnou imunitu
o brucelinový test - antigenem aktivované brucely nebo antigeny brucelin (brucelergen); pro
průkaz onemocnění jen omezený význam (promoření obyvatelstva, inaparentní infekce
v oblastech s výskytem brucelózy)
o Ducreyův test - intradermálně suspenze inaktivovaných hemofilů → dg. Haemophilus ducreyi -
sexuálně přenosný měkký vřed (ulcus molle)
o Freiův test - dg. sex. přenosného onemocnění lymphogranuloma venerum vyvolávaného
Chlamydia trachomatis - antigen Lygranum
o fungální onemocnění - pro jejich dg. - Histoplasma capsulatum - histoplasmin, Coccioides immitis
- kokcidioin
40. DIAGNOSTICKÉ GENOVÉ SONDY A PCR
- homologie řetězců dsDNA - po rozpletení (pH, teplo) a navrácení zpět do fyziologických poměrů, se
řetězce (nebo jejich fragmenty) opět párují s odpovídající homologní částí → umožňuje hledání
specifických úseků s jedinečnou sekvencí nukleových basí pomocí tzv. DNA sond
- DNA sona = v laboratoři vytvořený úsek DNA, dlouhý 14 - 40 ntd, homologní k hledané sekvenci, která je
typický pro určitý rod, druh nebo skupinu bakterií či virů
- sondy jsou značeny - radioaktivně nebo sloučeninou → barevná, světelná reakce
- pokud sonda v klinickém materiálu najde hledaný úsek → naváže se → podle značení identifikováno,
nenavázané sondy jsou ze směsi vymyty
- nalezení fragmentu genomu neprokazuje prezenci živého patogenu!!
- citlivost stoupá s počtem cílových sekvencí → vhodné vybrat např. části ribosomální RNA, které je v b. asi
10000x víc než totožné sekvence DNA
- nebo je možné cílovou sekvenci určitým způsobem pomnožit, amplifikovat, nejčastěji in vitro
o DNA → polymerázová řetězová reakce (PCR)
o RNA → amplifikace pomocí replikasy RNA fága Qβ
PCR
- dochází k exponenciálnímu pomnožování určitých úseků DNA - pro průkaz přítomnosti specif. sekvence
(většinou málo kopií → používá se jako matrice např. geny pro syntézu rRNA, je jich více)
o DENATURACE - rozštěpíme dsDNA na dvě ssDNA (pH, teplota nad 90°C)
o HYBRIDIZACE (dosednutí primerů) - používáme dva primery (na 5‘ konci může být značení jako u
DNA sond) → nasednou na specif. místo (renaturace, teplota už nižší 50 - 60°C) na matrici
o ELONGACE - od 3‘ konce primerů probíhá syntéza nových úseků DNA, které jsou homologní
k matrici (amplikony)
- poté znovu rozpleteme dsDNA a všechny řetězce (už jsou 4) slouží jako matrice
- celý cyklus se opakuje cca 30 - 40x (celkový počet sekvencí - 2 n , kde n je poč. opakování)
- po první cyklu jsou nové řetězce dlouhé, poté už se amplifikuje hledaný úsek od počátku jednoho primeru
ke konci primeru druhého
- složky reakční směsi:
o templát - neměl by být kontaminován, nesmí obsahovat látky, které inhibují DNA polymerasu
o primer
specifický, komplementární
71