ANÁLISIS ESTRUCTURAL DE LA PROTEÍNA EXTRÍNSECA PsbQ ...

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Índice
2.2. Expresión de la proteína PsbQ de espinaca recombinante y purificación. 38
2.2.1. Construcción del vector de expresión. 39
2.2.2. Aislamiento y purificación de la proteína PsbQ recombinante. 39
2.3. Análisis de la pureza por electroforesis en gel de poliacrilamida. 39
2.4. Cuantificación de la concentración de proteína. 41
2.5. Análisis del estado de la proteína y estudio de parámetros hidrodinámicos
por ultracentrifugación analítica. 42
3. Estudio de la estructura secundaria de PsbQ por técnicas bioinformáticas y
técnicas biofísicas 45
3.1. Predicción de estructura por técnicas bionformáticas. 45
3.2. Análisis estructural por dicroísmo circular (CD). 47
3.3. Análisis estructural por infrarrojos con transformada de Fourier (FTIR). 50
4. Estudio de la estructura terciaria de PsbQ por técnicas bioinformáticas y por
técnicas biofísicas 52
4.1. Predicción del plegamiento por métodos bioinformáticos. 52
4.2. Espectroscopía de absorción. 56
4.3. Espectroscopía de emisión de fluorescencia del triptófano. 57
4.3.1. Adquisición de espectros de emisión de fluorescencia. 57
4.3.2. Experimentos de atenuación de emisión de fluorescencia. 58
5. Cristalización y determinación estructural de la proteína PsbQ por difracción
de rayos-X 59
5.1. Obtención de cristales susceptibles de difracción. 59
5.2. Recogida de datos cristalográficos. 60
5.3. Derterminación de la estructura y refinado. 62
6. Estudios de la estabilidad conformacional de PsbQ 65
6.1. Preparación de la muestra. 65
6.2. Desnaturalización inducida por temperatura y por agentes químicos
estudiada por CD. 66
6.3. Desnaturalización inducida por temperatura y por agentes químicos
estudiada por fluorescencia intrínseca del triptófano. 67