ANÁLISIS ESTRUCTURAL DE LA PROTEÍNA EXTRÍNSECA PsbQ ...

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Materiales y Métodos
4.3.1. Adquisición de espectros de emisión de fluorescencia.
Las medidas de los espectros de emisión de fluorescencia se realizaron en un
espectrofluorímetro PTI tipo QM-2000-4 PTI (Photon Technology International) equipado con
baño termostatizado a 20 ºC. Para la adquisición de los espectros de emisión, el ancho de las
rendijas de los monocromadores de excitación y emisión se fijaron en 3 nm. Las longitudes de
onda de excitación fueron 280 nm, para la excitación de los residuos tirosinas y triptófano, y
295 nm, para la excitación específica del residuo triptófano. Los espectros de emisión de
fluorescencia se recogieron en la zona de 300-500 nm, cada 0.5 nm, con un tiempo de
integración de 2 s. Para cada medida se realizó la media de tres espectros. El espectro final se
corrigió sustrayendo la contribución de la banda Raman del agua y la señal del disolvente. Estas
medidas se realizaron a una concentración de PsbQ de entre 3.5-10 µM en 50 mM Tris-HCl pH
8.0.
4.3.2. Experimentos de atenuación de emisión de fluorescencia.
Para la realización de los experimentos de atenuación de emisión de fluorescencia por colisión se
utilizaron como agentes atenuadores la acrilamida, compuesto neutro-polar, y las sales CsCl y
KI, atenuadores positivos y negativos, respectivamente. Se prepararon disoluciones
concentradas (4 M) de acrilamida, CsCl y KI. A la disolución 4 M de KI se le añadió 1 mM
Na 2S 2O 3 para evitar la formación de I 3 - (Lehrer, 1971). Para mantener la fuerza iónica constante
en todas las experiencias se utilizó NaCl como sal inerte. En las experiencias con acrilamida, la
intensidad de fluorescencia se corrigió debido la absorción intrínseca de la misma según (Eftink
& Ghiron, 1976). Las curvas se analizaron según la ecuación modificada de Stern-Volmer, que
relaciona la disminución de la intensidad de fluorescencia del agente fluoróforo en presencia del
agente atenuador con la concentración del mismo según (Lakowicz, 1999):
F 0
F
V [ Q]
( 1+
K [ ] ) ⋅e
= [12]
SV Q
siendo F o y F las intensidades de fluorescencia en presencia y ausencia del agente atenuador Q;
K sv es la constante de colisión de atenuación o de Stern-Volmer; y, V, representa la constante
estática, que está relacionada con la probabilidad de que, al formase el nuevo estado excitado,