ANÁLISIS ESTRUCTURAL DE LA PROTEÍNA EXTRÍNSECA PsbQ ...

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Materiales y Métodos
La cuantificación de estructura secundaria α-hélice se determinó además según el método
clásico de Greenfield y Fasman (Greenfield & Fasman, 1969), que estima el porcentaje de α-hélice
a partir de la ecuación:
%
[ θ ]
208nm
− 4000
hélice =
33000 − 4000
α [10]
3.3. Análisis estructural por infrarrojos con transformada de Fourier (FTIR).
Los espectros de absorción de infrarrojos de proteínas contienen un número determinado de las
llamadas “bandas de amida” que representan diferentes modos de vibración del enlace peptídico
(Figura 15). De todas estas, la llamada banda de amida I es la que más se utiliza para el análisis
de estructura secundaria de proteínas (Haris & Chapman, 1995) (Jackson & Mantsch, 1995). Esta
banda es consecuencia de la vibración por estiramiento del enlace C=O del grupo amida acoplado
el estiramiento del enlace C-N. Estos modos de vibración, que se encuentran presentes como
bandas de infrarrojo entre aproximadamente 1600 y 1700 cm -1 , son sensibles a los enlaces por
puentes de hidrógeno y acoplamientos entre dipolos de transición de los enlaces peptídicos
adyacentes. De este modo, el análisis de la banda de amida I se utiliza para obtener datos sobre
la estructura secundaria de proteínas. Estos análisis incluyen deconvoluciones de Fourier,
derivadas y métodos iterativos de descomposición de la banda original (Byler & Susi, 1986), que
permiten identificar las diferentes bandas simples que corresponden a las distintas estructuras
presentes en la molécula y detectar cambios conformacionales observando la variación de la
frecuencia y la intensidad de estas bandas.
Tras la purificación de la proteína PsbQ, una parte fue liofilizada. Una alícuota de esta
muestra liofilizada se resuspendió en H 2O milliQ hasta alcanzar una concentración de proteína
de unos 30 mg/mL. Otra alícuota se resuspendió en D 2O puro para obtener una concentración de
proteína de unos 20 mg/mL.
El análisis de IR se hizo en un equipo de espectroscopía Nicolet Nexus 670 FT-IR,
equipado con un detector MCT/A enfriado con nitrógeno líquido y con un divisor de haz de Ge-
KBr. La velocidad de barrido del espejo fue de 2.53 cm/s, la resolución del espectro de 2 cm -1 ,
el rango de medida de 650-4000 cm -1 y por cada muestra se tomaron 1000 espectros
promediados. Se dispusieron 30 µl de muestra en una celda constituida por dos ventanas de CaF 2