ANÁLISIS ESTRUCTURAL DE LA PROTEÍNA EXTRÍNSECA PsbQ ...

Materiales y Métodos
el fluoróforo se encuentre en contacto directo con una molécula de atenuador y por tanto su
intensidad de fluorescencia sea atenuada inmediatamente.
5. Cristalización de la proteína PsbQ
5.1. Obtención de cristales susceptibles de difracción.
Para la determinación de la estructura de una proteína a partir de difracción de rayos-X es
necesaria la obtención de cristales de tamaño adecuado y con un orden interno capaz de
producir datos de alta resolución. Para que la cristalización de una proteína ocurra es necesario
tener una disolución sobresaturada de la misma que, al encontrarse en un equilibro metaestable,
tiende a alcanzar el equilibrio o bien formando precipitados o bien formando cristales (Durbin &
Feher, 1996) (Weber, 1991).
Solubilidad
Solubilidad
A B
Zona de
Equilibrio
Insaturación
Insaturación
Supersaturación
Supersaturación
Zona de
precipitación
[ [ Macromolécula Macromolécula ]
]
Solución
de proteína
Solución
madre
Figura 18. (A) Gráfico representando el equilibrio fase liquida-fase sólida en la cristalización
de proteínas (B) Esquema de la técnica de cristalización de proteínas por difusión de vapor en
gota colgante (Imagen cedida por Dr. J.A. Hermoso).
Los estudios de cristalización se realizaron usando fracciones de PsbQ recombinante de
alta concentración en 20 mM Tris-HCl pH 8.0. Para la obtención de cristales de PsbQ se empleó
el método de equilibrio por difusión de vapor en gota colgante. Para encontrar las condiciones de
cristalización idóneas, los primeros ensayos se hicieron usando la técnica de muestreo conocida
como Sparce Matrix, a partir de los kits comerciales "Crystal Screen I" y "Crystal Screen II"
de Hampton Research Corp. Se utilizaron placas de cristalización de 24 pocillos donde se
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