ANÁLISIS ESTRUCTURAL DE LA PROTEÍNA EXTRÍNSECA PsbQ ...

Materiales y Métodos
permanece invariable con el tiempo. Esa distribución se ajusta a un modelo exponencial para
cada partícula. La información de este tipo de experimentos en el caso de sistemas de dos
componentes, o sea un disolvente inerte y una única clase de partículas, es la masa molecular. Si
la muestra contiene más de una masa de partículas el dato obtenido es una masa molecular
promedio en peso.
En la modalidad denominada velocidad de sedimentación, se impone una velocidad de
rotación a la muestra tal que la fuerza gravitatoria se imponga claramente a las otras dos. Así,
el resultado final es que todas las partículas acaban sedimentadas en el fondo de la celda,
obteniéndose un sobrenadante, libre por completo de partículas, y una interfase, más o menos,
nítida según la difusión de las partículas. La información experimental se consigue midiendo el
desplazamiento de esa frontera con el tiempo. Estos experimentos proporcionan datos
hidrodinámicos como el coeficiente de sedimentación, de fricción y de difusión, y de ellos se
puede especular sobre la forma y el tamaño de las partículas.
Los experimentos de equilibrio de sedimentación de la proteína PsbQ recombinante se
realizaron en una ultracentrífuga analítica Optima XL-A (Beckman Coulter Instrument, Inc.)
equipada con celdas de doble sector de 12 mm de longitud óptica (rotor AN50Ti). La muestra,
80 µl de una disolución de PsbQ con una concentración de 1.1 mg/mL en 20 mM Tris-HCl pH 8.0,
se centrifugó a 120000 g a 20 ºC. Se midió la absorbancia de la muestra a 280 nm en función de
la distancia radial a las 12, 16 y 18 h, obteniéndose los mismos resultados lo que confirmaba que
la muestra estaba en equilibrio. La línea de base correspondiente a la aportación del tampón a la
señal se determinó por midiendo la absorbancia cerca del menisco tras centrifugar la muestra
durante 8 h a 200000 g. La masa molecular aparente de la proteína se obtuvo por ajuste no
lineal aplicando el modelo de una única especie de equilibro de sedimentación a cada conjunto de
datos según los programas EQASSOC y XLAEQ (Minton, 1994).
Ar o
o
−
] + B
2 2 2
= A ⋅exp[
M ⋅(
1−υ
ρ)
⋅(
r − r ) ⋅(
ω / 2RT
)
[3]
siendo A r y A o las absorbancias correspondientes al radio r y al radio de referencia r o; ω, la
velocidad angular de rotación; R, la constante de los gases; T, la temperatura; υ , el volumen
específico parcial; ρ, la densidad de la disolución; y B, la contribución del tampón. El volumen
específico parcial y la densidad de la disolución de PsbQ se estimaron con el programa
SEDNTERP (Laue, 1992) a partir de la composición de aminoácidos.
Los experimentos de velocidad de sedimentación se realizaron en la misma
ultracentrífuga a 20 ºC y 150000 g usando 400 µl de una disolución de proteína con una
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