ANÁLISIS ESTRUCTURAL DE LA PROTEÍNA EXTRÍNSECA PsbQ ...

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Materiales y Métodos
y concentración constante de proteína. Para los experimentos de replegamiento se mezclaron
volúmenes de una disolución de proteína concentrada en 6.0 M GdnHCl con cantidades adecuadas
de una disolución concentrada de GdnHCl y el mismo tampón hasta alcanzar concentraciones
diluidas de agente desnaturalizante (6.0-0.12 M) y una concentración de proteína constante y
similar a la utilizada en los ensayos de desnaturalización. Estas disoluciones se incubaron
durante toda la noche a 20 ºC para alcanzar el equilibrio químico.
El efecto del pH en la desnaturalización térmica se estudió diluyendo una disolución
concentrada de PsbQ en el tampón adecuado. El pH final de la disolución se comprobó tras
dilución con un pH-metro Radiometer (PHM210). Las muestras que iban a ser estudiadas por
DSC se prepararon por diálisis, utilizándose este tampón como referencia en las medidas. Los
tampones usados (50 mM) fueron: citrato-HCl (pH 2.0-3.5), acetato-HCl (pH 4.0-5.0),
K 2HPO 4/KH 2PO 4 (pH 6.0-8.0) y 20 mM Tris-HCl (pH 8.0).
6.2. Desnaturalización inducida por temperatura y por agentes químicos estudiada por CD.
La desnaturalización térmica de PsbQ se estudió por CD en el UV-lejano y UV-cercano usando
un espectropolarímetro Jasco, modelo J-810, acoplado a un sistema de control de temperatura
tipo Peltier; la desnaturalización química por GdnHCl se analizó en el UV-lejano usando un
espectropolarímetro Jasco, modelo J-720, equipado con un baño termostatizado (Neslab RTE-
110). Los espectros finales fueron una media de entre dos y cuatro acumulaciones, a los que se
les restó la señal del tampón. Las medidas se realizaron entre 195-260 nm (UV-lejano) y 260-
320 nm (UV-cercano), con una concentración final de PsbQ de 10 µM y 90 µM, y cubetas de
cuarzo de 1.0 mm y 10.0 mm de paso óptico, respectivamente. Los parámetros de medida se
fijaron en: velocidad de barrido de 20 nm/min, ancho de banda espectral de 1 nm y tiempo de
respuesta de 4 s. Las curvas de desnaturalización por temperatura se obtuvieron midiendo la
variación de señal de CD, a 220 nm (UV-lejano) y 291 nm (UV-cercano), entre 20 y 90 ºC a una
velocidad constante de barrido 20 ºC/h y tomando puntos cada 0.2 ºC. Finalizada la rampa de
desnaturalización térmica, la reversibilidad se comprobó inmediatamente después repitiendo el
espectro de CD de la proteína bajo las mismas condiciones iniciales. Las curvas de
desnaturalización/renaturalización en función de la concentración de GdnHCl se obtuvieron
midiendo la variación de la señal a 220 nm a 20 ºC. Para ello se obtuvo la media del valor a esta
longitud de onda durante 10 min, con tiempo de respuesta de 8 s e intervalos de 10 s.