ANÁLISIS ESTRUCTURAL DE LA PROTEÍNA EXTRÍNSECA PsbQ ...

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48 Materiales y Métodos 3.2. Análisis estructural por dicroísmo circular (CD). Las proteínas presentan actividad óptica en la zona del UV-lejano (180-240 nm) debido al carácter quiral que adquiere el enlace peptídico al encontrarse en un entorno rígido y, por tanto, asimétrico en la estructura proteica. Por tanto, en esta zona, la técnica de CD es muy sensible a la estructura secundaria que adopta una proteína y cada elemento de estructura secundaria (α- hélice, hoja-β, giros y otros) tiene un espectro de CD característico (Woody, 1995) (Figura 14). A B C θ (deg cm2 dmol-1 θ (deg cm ) 2 dmol-1 θ (deg cm ) 2 dmol-1 ) λ (nm) α-hélice hoja-β giros desordenada Figura 14. Representación de la propiedad del dicroísmo circular de las sustancias con actividad óptica. (A) Al incidir luz polarizada linealmente con igual proporción de luz polarizada circular a izquierdas y a derechas, estas sustancias absorben preferentemente en una dirección (B) la luz polarizada lineal incidente original, suma de los vectores circulares con igual amplitud pero sentido opuesto, se transforma en luz polarizada elípticamente al incidir sobre la muestra (C) espectros característicos de las diferentes conformaciones de estructura secundaria aisladas en proteínas. La caracterización de estructura secundaria por CD se realizó usando un espectropolarímetro tipo Jasco 720. Una alícuota de la proteína PsbQ liofilizada se diluyó en 20mM Tris-HCl pH 8.0 hasta alcanzar una concentración de 1.0 mg/mL. La muestra se desgasificó y su espectro se recogió en la zona entre 183-260 nm en una celda de cuarzo de 0.1 mm de paso óptico a 25 ºC. El espectro final fue una media de dos acumulaciones, velocidad de
Materiales y Métodos barrido de 20 nm/min, ancho de banda espectral de 1 nm y tiempo de respuesta de 4 segundos. Los valores de elipticidad se convirtieron en valores de elipticidad media por residuo según la masa molecular (16653 Da) y los residuos por mol (150 aminoácidos) de PsbQ recombinante mediante la ecuación: [ ] θ obs ⋅ MRW = 10⋅ d ⋅C θ λ [9] siendo [θ] λ el valor de la elipticidad molar a la longitud de onda λ; θ obs, el valor de elipticidad observado; MRW, la masa por residuo medio; d, el paso óptico; y, C, la concentración de proteína. El estudio de la estructura secundaria de PsbQ a partir de su espectro de CD se realizó mediante el uso de bases de datos de espectros de CD de proteínas de referencia formadas por elementos conocidos de estructura secundaria. Se combinaron los resultados procedentes de varios programas, que utilizan diferentes funciones matemáticas para construir el grupo de proteínas de referencia (Johnson, 1990) (Greenfield, 1996): -LINCOMB, incorpora el método de regresión no lineal por mínimos cuadrados de Perczel et al (Perczel et al, 1992) y usa el grupo de datos de referencia de Yang et al (Yang et al, 1986). -SELCON3 (Sreerama & Woody, 2000), que incorpora el método de auto-consistencia junto con un algoritmo de descomposición del valor singular (SVDA) para asignar la estructura secundaria de la proteína. -CDSSTR (Johnson, 1999), que implementa un método de selección de variables realizando todos los cálculos posibles usando un número fijo de proteínas a partir de un conjunto de referencia. -CONTIN/LL, que implementa el algoritmo de regresión contraída de Provencher y Glockner (Provencher & Glockner, 1981) junto con el modelo linealizado localmente de Van Stokkum et al (van Stokkum et al, 1990) para seleccionar un conjunto de proteínas a partir de la base de datos de referencia -CDNN (Dalmas et al, 1994), método de deconvolución basado en redes neuronales que aplican el algoritmo de propagación inversa. 49
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Resultados bacteria y su función e
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Apéndice Apéndice, D. Alineamient
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Apéndice, F . Alineamiento de secu
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