ANÁLISIS ESTRUCTURAL DE LA PROTEÍNA EXTRÍNSECA PsbQ ...

6. Estabilidad conformacional de PsbQ
6.1. Desnaturalización inducida por agentes químicos.
Resultados
El estudio de la estabilidad conformacional de PsbQ frente a la desnaturalización química se
realizó usando GdnHCl como agente desnaturalizante y se analizó por CD (UV-lejano) y emisión
de fluorescencia del triptófano. En la Figura 54A se muestra el espectro de CD de PsbQ en
presencia de diferentes concentraciones de GdnHCl a pH 8.0 y 20 ºC. La disminución de la
elipticidad a 220 nm sugiere una pérdida progresiva de estructura de α-hélice durante el
proceso de desnaturalización. A 6.0 M GdnHCl el espectro de CD de PsbQ es característico de
una proteína que ha perdido prácticamente toda su estructura secundaria. El estudio de
renaturalización se realizó diluyendo la muestra de proteína desnaturalizada, y revela que la
desnaturalización de PsbQ por GdnHCl es un proceso reversible. En la Figura 54B se representa
el cambio de la elipticidad a 220 nm en función de la concentración de GdnHCl; se observa una
única transición entre 0.2 M y 1.2 M de concentración de agente desnaturalizante, con un valor
de [GdnHCl]1/2 igual a 0.8 M. El cálculo de la energía libre de desplegamiento por el método de
extrapolación lineal (L.E.M.) se realizó por un ajuste de mínimos cuadrados a la ecuación [17],
asumiendo un mecanismo de dos estados, lo que condujo a un valor medio de ∆GD H2O = 4±1
kcal/mol y m = 5±1 kcal/mol/M a 20 0 C y pH 8.0.
CD (mdeg)
A B
0
40
30
20
10
0
-10
-20
-30
200 210 220 230 240 250 260
λ (nm)
0M
0.03M
0.06M
0.6M
0.9M
3M
4.5M
6M
6MCG_dil1:50
CD (mdeg) (mdeg)
-5
-10
-15
-20
0 1 5 6
[GdnHCl] (M)
Figura 54. Desnaturalización de PsbQ por GdnHCl según la técnica de CD. (A) Espectros de PsbQ a
diferentes concentraciones de GdnHCl y estudio de la reversibilidad tras diluir 50 veces con tampón la
muestra en 6.0M GdnHCl 50 veces (6MCG_dil1:50). (B) Curva de desnaturalización (cuadrados negros)
y renaturalización (puntos azules) a 220 nm en función de la concentración de agente desnaturalizante.
Se incluye el ajuste por mínimos cuadrados a la ecuación [17] (línea continua).
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