ANÁLISIS ESTRUCTURAL DE LA PROTEÍNA EXTRÍNSECA PsbQ ...

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Materiales y Métodos
alcanzar una densidad óptica de 1.2 unidades de absorción a 550 nm, en cubetas de paso de luz
de 1 cm. Inmediatamente se indujo la expresión de PsbQ recombinante mediante la adición de 1
mM IPTG. Tras 15-18 horas de incubación en agitación a 28 ºC las células se recogieron tras
centrifugación a 3000 g.
El precipitado de células se resuspendió en 1/20 parte del volumen original del cultivo y
se sonicaron en 0.8 M Tris-HCl pH 8.4 conteniendo 1 mM PMSF durante 30 min. Este inhibidor
de proteasas se encontraba también presente en el resto de los tampones utilizados. Las células
que no se rompieron y otros fragmentos celulares se eliminaron mediante centrifugación a
150000 g durante 45 min. Las proteínas de mayor masa molecular se precipitaron parcialmente
con sulfato amónico al 45% y se eliminaron tras centrifugar a 150000 g durante 30 min. Las
proteínas solubles restantes se precipitaron mediante la adición de sulfato amónico al 100%; el
precipitado resultante tras centrifugación a 150000 g durante 30 min se resuspendió en 20 mM
Tris-HCl pH 8.0 y 1 mM EDTA (tampón A) y se dializó frente a un volumen 500 veces mayor del
mismo tampón a 4ºC durante toda la noche. El material insoluble se eliminó mediante
centrifugación a 150000 g durante 45 min. Las proteínas solubles se resolvieron
cromatográficamente de manera similar al procedimiento descrito para la proteína PsbQ nativa.
2.3. Análisis de la pureza por electroforesis en gel de poliacrilamida.
Para comprobar la pureza de la disolución que contiene a la proteína PsbQ se realizó una
electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE) en un
equipo de electroforesis vertical Mini-PROTEAN 3 (Biorad). Para ello se utilizó el método de
Laemmli (Laemmli, 1970). Los geles se montaron sobre placas de cristal de tamaño 0.75mm x
10cm x 7cm, de composición:
Gel separador-
Acrilamida/N,N’-metilenbiscacrilamida 14% p/V
Tris-HCl 375 mM, pH 8.8
SDS 0.1% p/V
Persulfato amónico 0.05% p/V
TEMED 0.007% p/V
Gel concentrador-
Acrilamida/N,N’-metilenbiscacrilamida 1.5% p/V